研究課題
本研究の目的は、胎生期に生じた一時的なエピジェネティクス変化が、その後の発生・成長を経て、成体の生理機能においてどのような長期的影響を与えうるか明らかにすることである。本研究では、胎生期におけるDNAメチル化を形成するde novo DNAメチル化酵素のひとつDnmt3aに着目する。遺伝子改変によってあらかじめDnmt3aの遺伝子機能を発揮できないようにしておき、薬剤投与など外部からの誘導によって遺伝子機能が回復するような動物（マウス）を樹立する。この動物モデルを用いてDnmt3a機能を胎生期のみ抑制することによって、胎生期に生じたDNAメチル化変化が成体の生理機能に及ぼす影響を観察できることを期待する。具体的には、Dnmt3a酵素活性中心をコードするエクソンの上流イントロンに、遺伝子上流からの転写伸長をブロックする転写停止配列をCRISPR/Cas9により挿入する。そこで、対象とするイントロン領域のsgRNA候補配列を探索した。本研究の目的から、切断候補領域はエクソン、スプライシング配列など機能的に必須の部位を避ける必要がある。さらに対象ゲノム領域に反復配列が多数含まれているため、sgRNA候補配列の選択に大きな制限があった。そのため、候補配列の選択基準を緩和して選択した複数のsgRNAを作成し、それらの切断効率および特異性をマウスES細胞を用いて検討した。これらの結果にもとづいて、対象領域へのCRISPR/Cas9ノックインに用いることのできるDnmt3a-sgRNA配列を選別・同定し、その発現ベクターを作製した。
3: やや遅れている
目的遺伝子の対象領域におけるCRISPRノックインに適したsgRNA配列の選別に時間を要した。
細胞レベルでの遺伝子機能欠損および誘導的機能回復の動作を検証し、マウス作製を進める
おおむね計画どおりの使用額であったが、細胞・分子レベルの実験を中心に実施しており、前年度の繰上げ分を使用するまでにはいたらなかった。今年度の研究内容にくわえ、動物実験を実施していく。
すべて 2021 2020
すべて 雑誌論文 (2件) (うち国際共著 1件、 査読あり 2件、 オープンアクセス 2件)
Cells
巻: 10 ページ: 266～266
10.3390/cells10020266
Experimental Cell Research
巻: 396 ページ: 112279～112279
10.1016/j.yexcr.2020.112279
