| 研究課題/領域番号 |
19K08346
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| 研究機関 | 鳥取大学 |
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研究代表者 |
岡崎 哲也 鳥取大学, 医学部附属病院, 助教 (30465299)
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| 研究分担者 |
檜垣 克美 鳥取大学, 研究推進機構, 准教授 (90294321)
難波 栄二 鳥取大学, 研究推進機構, 教授 (40237631)
足立 香織 鳥取大学, 研究推進機構, 助教 (50609237)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 福山型筋ジストロフィー / fukutin / 知的障害 |
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| 研究実績の概要 |
福山型筋ジストロフィー（FCMD）症例は、筋症状だけでなく知的障害を認める。中枢神経の所見として、大脳皮質形成異常が知られている。FCMD以外の大脳皮質形成異常では、mTOR経路の異常が病態に強く関与していることが分かってきている。FCMD同様に知的障害、大脳皮質形成異常を来す結節性硬化症では、合併する腎血管筋脂肪腫などに保険適応となっているmTOR阻害剤が、てんかんの症状にも効果があることが知られている。FCMDの皮質形成異常とmTOR経路の関係は不明だが、モデルマウスの筋組織ではmTOR経路の障害が生じていると考えられ、mTOR阻害剤投与により、筋の組織学的改善を示したとの研究報告がある。FCMDの中枢神経障害にもmTOR経路異常が関与している可能性がある。本研究の目的は中枢神経症状へのmTOR経路異常の関与を解明し、治療法の開発に結びつけることである。得られる知見はFCMDの中枢神経症状だけでなく、知的障害全体の治療研究に大きく貢献できると考えられる。
本年度は以下に関し研究を進めた。
1）FKTNをsiRNAにてノックダウンしたヒト由来培養神経細胞の樹立
2）1）に対するmTOR経路障害に対する評価
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度はsiRNAを用いてFKTNをノックダウンしたヒト由来培養神経細胞の樹立、ならびにこれを用いて神経細胞においてmTOR経路の障害が生じていることを示すことを目的とし研究を進めた。はじめに、使用するsiRNAおよびmTOR経路に関する抗体の選定、準備を実施した。進捗がやや遅れている要因として、使用するsiRNAや抗体の選定、準備に時間を要したこと、ならびにCOVID-19の感染拡大に伴う納期の遅延が挙げられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和２年度は、FCMD疾患モデル細胞を用いたmTOR経路異常の解明を行っていく。
a) ヒト由来培養神経細胞のfukutinをsiRNAでノックダウンした細胞を用いる。既知のmTOR経路に関与するタンパク発現を抗体を用いた免疫染色、ウエスタンブロット法、リアルタイムPCR等で確認し、mTOR異常ならびにその部位を明らかにする。はじめに筋組織で報告があるmTORシグナルの上流分子のAktに着目する。次に、mTORC1シグナル経路についても検討を行う。
上記検討の他に、次世代シークエンサーを用いて網羅的なRNA発現解析を行い、mTOR経路以外の経路についても、コントロールと比較し、有意に発現が異なる遺伝子を探索する。
b) 神経細胞形成異常の検討; 共焦点レーザー顕微鏡を用いて神経細胞の形態学的特徴を明らかにする。
c)上記で解明したmTOR経路異常から、治療候補薬剤をリストアップする。fukutinのノックアウトマウスの筋組織では、mTORC１活性上昇があり、mTOR阻害剤であるラパマイシン投与で筋細胞の形態異常が改善したという報告がある。
d) FCMD疾患モデル細胞を用いて、治療候補薬投与による神経細胞形態の改善、mTOR経路異常の改善を確認する。mTOR阻害剤の効果については、リン酸化mTORの発現量を指標に、ウエスタンブロット法により検討を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究では、まずヒト培養神経細胞のFKTN遺伝子をsiRNAを用いてノックダウンして疾患モデル細胞を作成する。その上でこの細胞に生じていると考えられるmTOR経路の障害を明らかにすることを目的としている。mTOR経路の障害を明らかにするために複数の抗体を用いる。コロナウイルス感染症の感染拡大の影響で中国で製造されている抗体の一部の納品が年度内に困難だったことがまず挙げられる。その他、実験の結果で抗体の追加購入や変更を検討する予定があり、令和２年度の実験の結果に応じてさらに購入を行う予定である。
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