難治性小児急性骨髄性白血病のエピゲノム機構の解明

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K08350
• 研究機関: 横浜市立大学
• 研究代表者: 柴 徳生 横浜市立大学, 附属病院, 講師 (50600615)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: 急性骨髄性白血病 / Chipシーケンス / microRNAシーケンス / 遺伝子解析 / ATACシーケンス

研究実績の概要

小児急性骨髄性白血病(AML)は小児がんにおいて最も予後不良な疾患の1つであり、これまでの網羅的な遺伝子解析の結果、予後不良な遺伝子再構成であるNUP98-NSD1症例全例においてPRDM16遺伝子が高発現していることを同定し、さらに予後不良AMLの多くでPRDM16遺伝子が高発現となっていることを突き止め、重要なリスク因子として報告してきた。
今回、NUP98-NSD1陽性例2例を含む小児AML検体10例を用いて、ATAC-seq(Assay for Transposase-Accessible Chromatin Sequencing)を施行した。ATAC-seqは、次世代シーケンサーを用いた網羅的にオープンクロマチン領域、すなわち遺伝子の活性化した領域を同定する手法である。本解析により、遺伝子が機能している領域を検出するとともにオープン領域の遺伝子配列を調べることで、結合している転写因子を同定することが可能であり、協調して白血病化に寄与していると考えられる遺伝子群の抽出を試みた。その結果、予後不良であるPRDM16遺伝子高発現症例ではPRDM16遺伝子のpromotor領域ではなく、遺伝子bodyがpartialにオープンとなっていることを同定し、さらに遺伝子後半部に座位するストロングエンハンサー領域がオープンとなっていること、またモチーフ解析の結果、4つの転写因子を候補として同定した。さらに、予後不良AMLでは細胞増殖シグナルに関わるgene Xプロモーター領域がオープンとなっており、gene Xの発現が上昇、シグナルが活性化されていると考えられた。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

microRNAを施行するために用意した小児AML検体のqualityが悪く、十分な量のmicroRNAの確保が困難であった。今年度、すでに別の新たなRNAを48サンプル確保出来たため、より簡便で少ない量のRNAで網羅的にmicroRNAの発現を調べることが可能なnCounterを用いて解析を行う予定である。また、ATAC-seqで得られた結果から、オープンクロマチン領域自体、ならびに結合していると考えられる候補転写因子に対する抗体を利用して、CHIP-seqを行う予定であるが、使用する抗体のqualityを吟味してから行いたいと考えており、もっとも効率的に解析可能な抗体を選別するのに時間を要している。しかしながら、抗体の目途は立っており、今年度中にChip-seqを行う予定である。

今後の研究の推進方策

今後、ATAC-seqで得られた結果から、オープンクロマチン領域自体、もしくは結合していると考えられる4つの候補転写因子のAMLの関わりについて検討を行う。具体的には、PRDM16に対する抗体を利用し、CHIP-seqを行うことで、これらの遺伝子の関与が明らかにできものと考えている。また、これまでに我々の実施した網羅的メチル化アレイの結果、PRDM16遺伝子高発現症例ではPRDM16遺伝子は部分的に高度にメチル化され、ポリコームとの結合が障害されることも同定しており、その結果、ポリコーム抑制機能が解除され、HOX pathwayの活性化に繋がったと考えられる。この点についてはバイサルファイトシーケンス等を用いることで、結合部位のメチル化の程度を評価することで、このメカニズムを明らかにできるものと考えている。そして、gene X高発現株（THP-1など）を用いて、gene Xに対する阻害剤への効果を検討したいと考えている。
また、AMLは様々な遺伝子背景をもつヘテロな疾患であり、24～48例程度のサンプルを選別してミニモデルを作成し、nCounterを用いてmicroRNAシーケンスを施行する。その結果を遺伝子異常や遺伝子発現データと照合することで、予後良好例、不良例の差異を見出すと同時に白血病進展に関連するパスウェイの同定を試みる。
最終的には、PRDM16の近傍に存在する遺伝子をCHIP法で抽出した後、CHIP-seqを行い、DNAとタンパク質の結合部位を明らかにするとともに、プロテオーム解析を行い、周辺にリクルートされているタンパク質の同定を試みる。特に、PRDM16、ポリコームタンパク群（EZH2等）、HOX pathwayが難治性白血病の重要なターゲットになると考えられることから、これらの活性を阻害する標的を同定することは新規薬剤の開発につながることが期待される。

研究成果

• [雑誌論文] Transcriptome analysis offers a comprehensive illustration of the genetic background of pediatric acute myeloid leukemia (2019)
  • 著者名/発表者名: Shiba N, Yoshida K, Hara Y, Yamato G, Shiraishi Y, Matsuo H, Okuno Y, Kaburagi T, Takeuchi M, Ohki K, Sanada M, Okubo J, Tomizawa D, Taki T, Shimada A, Horibe K, Taga T, Adachi S, Tawa A, Miyano S, Ogawa S, Hayashi Y, et.al.
  • 雑誌名: Blood Advances 巻: 3 ページ: 3157～3169
  • DOI: 10.1182/bloodadvances.2019000404
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Patients aged less than 3 years with acute myeloid leukaemia characterize a molecularly and clinically distinct subgroup (2019)
  • 著者名/発表者名: Hara Yusuke、Shiba Norio、Yamato Genki、Ohki Kentaro、Tabuchi Ken、Sotomatsu Manabu、Tomizawa Daisuke、Kinoshita Akitoshi、Arakawa Hirokazu、Saito Akiko M.、Kiyokawa Nobutaka、Tawa Akio、Horibe Keizo、Taga Takashi、Adachi Souichi、Taki Tomohiko、Hayashi Yasuhide
  • 雑誌名: British Journal of Haematology 巻: 188 ページ: 528～539
  • DOI: 10.1111/bjh.16203
  • 査読あり
• [雑誌論文] Negative CD19 expression is associated with inferior relapse‐free survival in children with RUNX1‐RUNX1T1 ?positive acute myeloid leukaemia: results from the Japanese Paediatric Leukaemia/Lymphoma Study Group AML‐05 study (2019)
  • 著者名/発表者名: Sakamoto Kenichi、Shiba Norio、Deguchi Takao、Kiyokawa Nobutaka、Hashii Yoshiko、Moriya‐Saito Akiko、Tomizawa Daisuke、Taga Takashi、Adachi Soichi、Horibe Keizo、Imamura Toshihiko
  • 雑誌名: British Journal of Haematology 巻: 187 ページ: 372～376
  • DOI: 10.1111/bjh.16080
  • 査読あり
• [雑誌論文] Whole transcriptome sequencing reveals a KMT2A‐USP2 fusion in infant acute myeloid leukemia (2019)
  • 著者名/発表者名: Ikeda Junji、Shiba Norio、Tsujimoto Shin‐ichi、Yoshida Masanori、Nakabayashi Kazuhiko、Ogata‐Kawata Hiroko、Okamura Kohji、Takeuchi Masanobu、Osumi Tomoo、Tomizawa Daisuke、Hata Kenichiro、Kiyokawa Nobutaka、Ito Shuichi、Kato Motohiro
  • 雑誌名: Genes, Chromosomes and Cancer 巻: 58 ページ: 669～672
  • DOI: 10.1002/gcc.22751
  • 査読あり
• [雑誌論文] Clinical and biological features of paediatric acute myeloid leukaemia ( AML ) with primary induction failure in the Japanese Paediatric Leukaemia/Lymphoma Study Group AML ‐05 study (2019)
  • 著者名/発表者名: Miyamura Takako、Moritake Hiroshi、Nakayama Hideki、Tanaka Shiro、Tomizawa Daisuke、Shiba Norio、Saito Akiko M.、Tawa Akio、Shimada Akira、Iwamoto Shotaro、Hayashi Yasuhide、Koike Takashi、Horibe Keizo、Manabe Atsushi、Mizutani Shuki、Taga Takashi、Adachi Souichi
  • 雑誌名: British Journal of Haematology 巻: 185 ページ: 284～288
  • DOI: 10.1111/bjh.15799
  • 査読あり
• [雑誌論文] Comparison of conditioning regimens for autologous stem cell transplantation in children with acute myeloid leukemia: A nationwide retrospective study in Japan (2019)
  • 著者名/発表者名: Sakaguchi H, Muramatsu H, Hasegawa D, Kudo K, Ishida H, Yoshida N, Koh K, Noguchi M, Shiba N, Tokimasa S, Fukuda T, Goto H, Miyamura T, Nakazawa Y, Hashii Y, Inoue M, Atsuta Y
  • 雑誌名: Pediatric Blood & Cancer 巻: 66 ページ: e27459～e27459
  • DOI: 10.1002/pbc.27459
  • 査読あり
• [雑誌論文] Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation for children and adolescents with high-risk cytogenetic AML: distinctly poor outcomes of FUS-ERG-positive cases (2019)
  • 著者名/発表者名: Tomizawa Daisuke、Yoshida Masanori、Kondo Tadakazu、Miyamura Takako、Taga Takashi、Adachi Souichi、Koh Katsuyoshi、Noguchi Maiko、Kakuda Harumi、Watanabe Kenichiro、Cho Yuko、Fukuda Takahiro、Kato Motohiro、Shiba Norio、Goto Hiroaki、Okada Keiko、Inoue Masami、Hashii Yoshiko、Atsuta Yoshiko、Ishida Hiroyuki
  • 雑誌名: Bone Marrow Transplantation 巻: 54 ページ: 393～401
  • DOI: 10.1038/s41409-018-0273-7
  • 査読あり
• [学会発表] The Detection of Minor Clones with Somatic KIT D8 16V Mutations Using Droplet Digital PCR in Pediatric De Novo AML: AML-05 Trial from the Japanese Pediatric Leukemia/ Lymphoma Study Group. (2019)
  • 著者名/発表者名: Sasaki K, Uchiyama Y, Ikeda J, Yoshitomi M, Shimosato-Wada Y, Tokumasu M, Matsuo H, Yoshida K, Oki K, Yamato G, Hara Y, Kinoshita A, Tomizawa D, Taga T, Adachi S, Tawa A, Horibe K, Matsumoto N, Ito S, Hayashi Y, Shiba N
  • 学会等名: 61st American Society of Hematology Annual Meeting
  • 国際学会
• [学会発表] Recurrent Gene Mutations in Peadiatric Patients with AML By Targeted Sequencing -the Jccg Study, JPLSG AML-05-. (2019)
  • 著者名/発表者名: Kaburagi T, Yamato G, Shiba N, Yoshida K, Hara Y, Shiraishi Y, Ohki K, Sotomatsu M, Arakawa H, Matsuo H, Shimada A, Taki T, Kiyokawa N, Tomizawa D, Horibe K, Miyano S, Taga T, Adachi S, Ogawa S, Hayashi Y
  • 学会等名: 61st American Society of Hematology Annual Meeting
  • 国際学会
• [学会発表] Clinical Features of Pediatric Acute Myeloid Leukemia with TP53 and CDKN2A/2B copy Number Alterations. (2019)
  • 著者名/発表者名: Hara Y, Taki T, Yamato G, Yoshida K, Shiozawa Y, Shiba N, Kaburagi T, Shiraishi Y, Ohki K, Kawamura M, Sotomatsu M, Arakawa H, Matsuo H, Shimada A, Toki T, Kiyokawa N, Tomizawa D, Tago T, Ito E, Horibe K, Miyano S, Ogawa S, Adachi S, Hayashi Y
  • 学会等名: 61st American Society of Hematology Annual Meeting
  • 国際学会
• [学会発表] Significant Feature of DNA Methylation at Bivalent Promotor and Repressed Polycomb Regions in Padiatric AML-the Jccg Study, JPLSG AML-05-. (2019)
  • 著者名/発表者名: Yamato G, Kawai T, Shiba N, Hara Y, Ohki K, Kaburagi T, Yoshida K, Shiraishi Y, Miyano S, Kiyokawa N, Tomizawa D, Shimada A, Sotomatsu M, Arakawa H, Adachi S, Tago T, Horibe K, Ogawa S, Hata K, Hayashi Y
  • 学会等名: 61st American Society of Hematology Annual Meeting
  • 国際学会
• [学会発表] Pediatric AML patients with FLT3-ITD/NUP98-NSD1 have maintained long-term complete remission. (2019)
  • 著者名/発表者名: Yoshitomi M，Shimosato Y，Sasaki K，Oya T，Takeuchi M，Shiba N，Ito S
  • 学会等名: 81st Annual Meeting of the Japanese Society of Hematology
• [学会発表] Recurrent gene mutations in pediatric AML by targeted sequencing using a 343-gene custom panel. (2019)
  • 著者名/発表者名: Kaburagi T, Yamato G, Shiba N, Yoshida K, Hara Y, Shiraishi Y, Ohki K, Sotomatsu M, Arakawa H, Matsuo H, Shimada A, Taki T, Kiyokawa N, Tomizawa D, Horibe K, Miyano S, Adachi S, Taga T, Ogawa S, Hayashi Y
  • 学会等名: 81st Annual Meeting of the Japanese Society of Hematology
• [学会発表] Comprehensive methylation analysis in pediatric AML patients -the JCCG, JPLSG AML-05 study-. (2019)
  • 著者名/発表者名: Yamato G, Kawai T, Shiba N, Hara Y, Ohki K，Kaburagi T, Yoshida K，Shiraishi Y, Miyano S, Kiyokawa N, Tomizawa D, Shimada A, Sotomatsu M, Arakawa H, Adachi S, Taga T，Horibe K, Ogawa S, Hata K, Hayashi Y
  • 学会等名: 81st Annual Meeting of the Japanese Society of Hematology
• [学会発表] ATAC-seqを用いた小児急性骨髄性白血病におけるオープンクロマチン領域の解析． (2019)
  • 著者名/発表者名: 池田順二，柴 徳生，飯塚淳広，吉富誠弘，佐々木康二，竹内正宣，鏑木多映子，大和玄季，原 勇介，林 泰秀，伊藤秀一
  • 学会等名: 第61回日本小児血液・がん学会
• [学会発表] 小児急性骨髄性白血病におけるdroplet digital PCRを用いたKIT D816V変異を有するminor cloneの検出． (2019)
  • 著者名/発表者名: 佐々木康二，柴 徳生，内山由理，徳舛麻友，松尾英将，吉田健一，大木健太郎，大和玄季，原 勇介，木下明俊，富澤大輔，多賀 崇，足立壮一，多和昭雄，堀部敬三，松本直通，伊藤秀一
  • 学会等名: 第61回日本小児血液・がん学会
• [学会発表] 小児急性骨髄性白血病患者におけるKMT2C変異とPHF6変異の臨床的意義について． (2019)
  • 著者名/発表者名: 鏑木多映子，大和玄季，柴 徳生，吉田健一，原 勇介，白石友一，大木健太郎，外松 学、荒川浩一，松尾英将，嶋田 明，滝 智彦，清河信敬，富澤大輔，堀部敬三，宮野 悟，足立壮一，多賀 崇，小川誠司，林 泰秀
  • 学会等名: 第61回日本小児血液・がん学会
• [学会発表] TP53遺伝子異常を伴う小児急性骨髄性白血病の臨床像と分子生物学異常の解析． (2019)
  • 著者名/発表者名: 原 勇介，滝 智彦，大和玄季，吉田健一，柴 徳生，鏑木多映子，白石友一，大木健太郎，川村眞智子，外松 学，荒川浩一，松尾英将，嶋田 明，土岐 力，清河信敬，富澤大輔，多賀 崇，伊藤悦朗，堀部敬三，宮野 悟，小川誠司，足立壮一，林 泰秀
  • 学会等名: 第61回日本小児血液・がん学会