| 研究課題/領域番号 |
19K08363
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
野中 綾 東京大学, 先端科学技術研究センター, 特任研究員 (50786621)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | AFP産生胃がん / オルガノイド / シングルセル解析 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は予後不良であるα-フェトプロテイン(AFP)産生胃がんの発生メカニズムを同定することである。AFP産生胃がん由来のオルガノイドは慶応大学から譲り受けた。このオルガノイドはWnt3aやR-spondin非存在下(EIA培地)で培養可能であるため、まずAFPの発現レベルをバルクで検出した。その結果、オルガノイド培養培地(Full 培地)ではAFP発現は顕出されないが、EIA培地で７日間培養後のAFP産生オルガノイドでは有意に亢進していることが確認された。
AFP胃がんの組織の免疫染色により、指標となるAFPの発現が不均一性を示すことが報告されている。そこで一細胞RNA解析により、どの様な細胞集団が存在するのか同定を行った。その結果、正常胃オルガノイドおよびFull培地培養のAFP産生胃がんオルガノイドはUMAP解析により主に細胞周期の状態でクラスタリングされた。これはサンプルが均一の細胞集団由来であることが考えられる。一方、EIA培地で培養したAFP産生胃がんオルガノイドは二方向へ分化していることがUMAP解析から明らかになった。GO解析および特異的に発現する遺伝子により、それぞれのクラスターは肝様細胞と腸管様細胞と明らかになった。また、指標となるAFPは、肝様細胞群の特定クラスターのみで発現していた。肝前駆細胞から肝細胞様に分化する遺伝子が発現しているが、RNA velocity解析により特定された分化方向により、ONECUT２とHHEXが初期に、GATA6が中期、PROX1およびHNF6が後期にとそれぞれ経時的に発現している事が明らかになった。これらの遺伝子は腸管様細胞のクラスターでの発現は抑制されていた。
これらの結果から、AFP産生胃がんは２方向性に分化する能力を有することから、胃および肝臓での増殖が可能となっていると考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の目的は、これまで発癌のメカニズムが不明であったAFP産生胃がんの分子機構の解明である。臨床検体のAFP免疫染色像は不均一性を示していたが、一細胞RNA解析でも同一のオルガノイドからAFPの発現が異なる細胞集団が発生することが確認された。さらに、AFP産生オルガノイドは、肝臓様細胞と腸管様細胞の２方向性に分化することが明らかになり、AFP産生胃がんの肝臓への転移能を示す結果となった。
RNA発現およびATACデータを同一細胞から得るために必要なトランスポゼースを、活性を保持し十分な量を大腸菌から精製することが可能となった。よって、おおむね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
UMAP(次元削減手法)により一細胞RNAデータをクラスタリングしたが、実際にそれぞれのクラスターが存在するのか、またオルガノイドにどの様に分布しているか同定する。それぞれのクラスター特異的な分子は一細胞RNA解析ツールScanpyを用いて選び出し、それぞれの抗体を用いてオルガノイドの免疫染色を行う。免疫染色では厚みのあるオルガノイドに顕微鏡の焦点をあわせるために、SeeDB2と呼ばれる組織透明化試薬を用いる。
一細胞RNA解析とATAC解析を重ね合わせることにより、経時的働く転写因子を同定する。選び出した転写因子をCRISPR/Cas9またはshRNAを用いたノックダウンにより、オルガノイドの細胞分化がどの様に変化するのか同定する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度はすでに所有していた試薬で研究を行うことが可能になったことや試薬を譲り受けることができた。また一部試薬を自作したため当初予定した費用よりも少額となった。次年度の使用計画に大きな変更がないが、研究を加速するための試薬やキット購入に充てる。
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