| 研究課題/領域番号 |
19K08436
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| 研究機関 | 旭川医科大学 |
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研究代表者 |
藤井 裕美子 旭川医科大学, 医学部, 助教 (30722334)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | ヘリコバクター・ピロリ / 胃がん / CagA |
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| 研究実績の概要 |
CagAとSHIP2の結合責任領域を同定するため、CagAのEPIYAモチーフ内のチロシンをフェニルアラニンに置換したリン酸化耐性型CagAおよびSH2ドメイン欠損型SHIP2を用いて免疫沈降実験を行った。その結果、CagAのチロシンリン酸化依存的にSH2ドメインを介してSHIP2が結合することがわかった。CagAには4種のEPIYAセグメントがあるが、様々な組み合わせのEPIYAセグメントを持つCagAを使い、SHIP2が欧米型CagAに特徴的なEPIYA-Cセグメントに最も強く結合することを明らかにした。細胞内でCagA-SHIP2複合体が形成される位置をProximity Ligation Assayで調べたところ、細胞膜周辺において複合体が形成されていた。ピロリ菌を胃上皮細胞に感染させてSHIP2の細胞内局在を蛍光免疫染色で観察したところ、CagAを細胞に注入するピロリ菌を感染させた時にのみ、菌が接着した付近の細胞膜にSHIP2が集まっていた。CagA-SHIP2結合の意義を調べるため、SHIP2のホスファターゼ産物であるPI(3,4)P2を免疫染色で調べたところ、CagAが発現した細胞の細胞膜にPI(3,4)P2が集積していた。更に、CRISPR-Cas9システムでSHIP2をノックアウトした胃上皮細胞にcagA陽性ピロリ菌を感染させたところ、細胞内に注入されるCagA量が減少することが明らかになった。CagAが発がん活性を示す際にみられる細胞形態変化の量は、SHIP2の有無に依存して変動した。以上のことから、SHIP2はCagAに結合することで細胞膜のホスファチジルイノシトールの組成を変化させ、それによりCagAの細胞内への取り込みの過程に関わることが強く示唆された。この成果はcagA陽性ピロリ菌感染を起点とした胃発がんの予防を考える際に重要な知見となり得る。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
申請時に設定した研究計画のうち、2019年度に目標としていた成果の大部分を予定通りに出すことができた。更に、翌年度以降に計画していた実験にも着手して現段階までの成果をまとめ、国際紙に発表することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
申請時に立てた本研究の大きな目的は、CagA-SHIP2結合メカニズムの解明とCagA-SHIP2複合体形成の病態生理学的意義を明らかにすることであったが、本年度までに、結合メカニズムの解明は完了し、複合体形成の意義についても一部明らかにすることができた。今後はSHIP2の異常なホスファターゼ活性亢進が細胞に及ぼす影響、特に発がんにつながる分子メカニズムについて、in vivoの実験系も用いて解析していく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
年度途中で研究環境を移動したため、申請などの準備が必要となる動物実験や高額なキットを使用する実験を一部翌年度以降に延期した。更に、本年度は旅費と学会参加費を使用しなかったため未使用額が生じた。次年度は着手を延期していた動物実験等を開始する際に、本未使用額相当が必要となる。また、学会参加の際に以前より移動費がかかることが見込まれるため、本年度分で充填する予定である。
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