腸管上皮オートファジーによる新規免疫調節機構の解析とクローン病新規治療標的の抽出

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K08438
• 研究機関: 東京医科歯科大学
• 研究代表者: 長堀 正和 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 准教授 (60420254)
• 研究分担者: 永石 宇司 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 寄附講座准教授 (60447464) ; 渡辺 守 東京医科歯科大学, 高等研究院, 特別栄誉教授 (10175127)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: 腸管免疫 / 腸管上皮 / 炎症性腸疾患

研究実績の概要

本研究は申請者らがこれまで見出してきた「腸管粘膜の免疫恒常性は腸管上皮細胞のオートファジー機能と粘膜内リンパ球とのクロストークによって制御され、その破綻がIBDの本態となる」という独自の概念や知見を基盤として、オートファジーによる腸管粘膜の免疫調節機構を解明しつつ、その機能不全によって誘導される免疫異常からクローン病に対する新規治療標的を抽出することを目指し、研究を遂行している。その結果、本研究では当該研究期間に以下のような成果が得られた。１）我々の腸管上皮培養技術を用いて野生型 (WT) および大腸上皮特異的Atg5欠損マウス腸管組織から単離した腸管上皮細胞を初代培養した結果、WTと同様にAtg5欠損マウス由来の腸管上皮からでもオルガノイドを作製することに成功した。２）WTオルガノイドにstarvation等によってオートファジーを誘導した結果、共焦点顕微鏡下でLC3の凝集が確認された。３）またWTオルガノイドの生化学的解析では、LC3-Ⅱやp62の発現上昇が確認された。４）さらに阻害剤によってWTオルガノイドのオートファジーの誘発を抑制した結果、LC3の凝集形成やLC3-Ⅱ、p62の発現の発現が抑制されることが確認された。これらの研究成果は上記の条件下における腸上皮オルガノイドのオートファジー機能が正常に誘導されており、免疫応答を含めたその他の生理機能を生化学的、細胞生物学的に解析することが可能であることを示唆する。さらに現在、これらの細胞を用いた免疫学的解析にむけて、その条件検討を進めている。さらに、in vivo実験系では遺伝子改変動物における疾患モデルの誘導とその臨床および病理学的解析、フローサイトメトリー、サイトカイン測定、また免疫組織染色などを現在試みている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

クローン病の病態はオートファジーの機能不全によって誘導される免疫異常が根幹にあり、腸管粘膜の免疫恒常性が腸管上皮細胞のオートファジー機能と粘膜内リンパ球とのクロストークによって制御されていることに着目しているが、今回我々はマウスから樹立した腸上皮オルガノイドにおいて生理的なオートファジー機能を確認し、またその解析系を樹立できたことは大きな成果であるといえる。

今後の研究の推進方策

次年度は腸管上皮による免疫応答の調節メカニズムに着目し、これを詳細に解析するためにin vitroおよびex vivo実験系ではオートファジー機能不全のオルガノイドを用いて共焦点・二光子顕微鏡下での細胞内小器官の観察、分子生物学的解析、そしてリンパ球との混合培養系でのサイトカイン産生や増殖能の解析を、またin vivo実験系では遺伝子改変動物における疾患モデルの誘導とその臨床および病理学的解析、フローサイトメトリー、サイトカイン測定、また免疫組織染色などを行う予定である。

次年度使用額が生じた理由

理由：試薬等が計画当初より廉価で購入可能であったため。
使用計画：　検討する数・種類を拡大して解析を行うため、試薬を増量して購入する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Receptor-interacting protein kinase 3 (RIPK3) inhibits autophagic flux during necroptosis in intestinal epithelial cells. (2020)
  • 著者名/発表者名: Kana Otsubo, Chiaki Maeyashiki, Yoichi Nibe, Akiko Tamura, Emi Aonuma, Hiroki Matsuda, Masanori Kobayashi, Michio Onizawa, Yasuhiro Nemoto, Takashi Nagaishi, Ryuichi Okamoto, Kiichiro Tsuchiya, Tetsuya Nakamura, Satoru Torii, Eisuke Itakura, Mamoru Watanabe, Shigeru Oshima.
  • 雑誌名: FEBS Lett. 巻: 594 ページ: 1586-1595
  • DOI: 10.1002/1873-3468.13748.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Evidence-based diagnosis and clinical practice guidelines for intestinal Behçet's disease 2020 edited by intractable diseases, the Health and Labour Sciences Research Grants. (2020)
  • 著者名/発表者名: Kenji Watanabe , Satoshi Tanida , Nagamu Inoue , Reiko Kunisaki , Kiyonori Kobayashi , Masakazu Nagahori , Katsuhiro Arai , Motoi Uchino , Kazutaka Koganei , Taku Kobayashi , Mitsuhiro Takeno , Fumiaki Ueno , Takayuki Matsumoto , Nobuhisa Mizuki , Yasuo Suzuki , Tadakazu Hisamatsu
  • 雑誌名: J Gastroenterol. 巻: Epub ahead of print ページ: in press
  • DOI: 10.1007/s00535-020-01690-y.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Development and validation of a deep neural network for accurate evaluation of endoscopic images from patients with ulcerative colitis. (2020)
  • 著者名/発表者名: Kento Takenaka , Kazuo Ohtsuka , Toshimitsu Fujii , Mariko Negi , Kohei Suzuki , Hiromichi Shimizu , Shiori Oshima , Shintaro Akiyama , Maiko Motobayashi , Masakazu Nagahori , Eiko Saito , Katsuyoshi Matsuoka , Mamoru Watanabe
  • 雑誌名: Gastroenterology 巻: Epub ahead of print ページ: in press
  • DOI: 10.1053/j.gastro.2020.02.012.
  • 査読あり
• [雑誌論文] CD8αα+ T cells show amoeboid shape and frequent morphological change in vitro, and localize to small intestinal intraepithelial region in vivo. (2020)
  • 著者名/発表者名: Yuria Takei, Yasuhiro Nemoto, Ryo Morikawa, Shohei Tanaka, Shigeru Oshima, Takashi Nagaishi, Ryuichi Okamoto, Kiichiro Tsuchiya, Tetsuya Nakamura, Mamoru Watanabe.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun. 巻: 523 ページ: 328-335
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2019.12.021.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] High-fat diet-derived free fatty acids impair the intestinal immune system and increase sensitivity to intestinal epithelial damage. (2020)
  • 著者名/発表者名: Shohei Tanaka, Yasuhiro Nemoto, Yuria Takei, Ryo Morikawa, Shigeru Oshima, Takashi Nagaishi, Ryuichi Okamoto, Kiichiro Tsuchiya, Tetsuya Nakamura, Susanne Stutte, Mamoru Watanabe.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun. 巻: 522 ページ: 971-977
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2019.11.158.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Indolent T cell lymphoproliferative disorder with villous atrophy in small intestinediagnosed by single-balloon enteroscopy. (2019)
  • 著者名/発表者名: Takashi Nagaishi, Daiki Yamada, Kohei Suzuki, Ryosuke Fukuyo, Eiko Saito, Masayoshi Fukuda, Taro Watabe, Naoya Tsugawa, Kengo Takeuchi, Kouhei Yamamoto, Ayako Arai, Kazuo Ohtsuka, Mamoru Watanabe.
  • 雑誌名: Clin J Gastroenterol. 巻: 12 ページ: 434-440
  • DOI: 10.1007/s12328-019-00971-1.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Small bowel healing detected by endoscopy in patients with Crohn's disease after treatment with antibodies against tumor necrosis factor. (2019)
  • 著者名/発表者名: Kento Takenaka , Toshimitsu Fujii , Kohei Suzuki , Hiromichi Shimizu , Maiko Motobayashi , Shuji Hibiya , Eiko Saito , Masakazu Nagahori , Mamoru Watanabe , Kazuo Ohtsuka
  • 雑誌名: J Gastroenterol Hepatol. 巻: 18 ページ: 1545-1552.
  • DOI: 10.1016/j.cgh.2019.08.024.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Predictors of mucosal healing during induction therapy in patients with acute moderate-to-severe ulcerative colitis. (2019)
  • 著者名/発表者名: Maiko Motobayashi, Katsuyoshi Matsuoka, Kento Takenaka, Toshimitsu Fujii, Masakazu Nagahori, Kazuo Ohtsuka, Fumihiko Iwamoto, Kiichiro Tsuchiya, Mariko Negi, Yoshinobu Eishi, Mamoru Watanabe
  • 雑誌名: J Gastroenterol Hepatol. 巻: 34 ページ: 1004-1010
  • DOI: 10.1111/jgh.14565.
  • 査読あり
• [学会発表] B cell receptor signaling in lymphoid tissues may be regulated by CEACAM1. (2020)
  • 著者名/発表者名: Takashi Nagaishi, Naoya Tsugawa, Daiki Yamada, Taro Watabe, Michio Onizawa, Mamoru Watanabe.
  • 学会等名: European Crohn’s and Colitis Organization 2020
  • 国際学会
• [学会発表] IBDモデルにおける腸管二次リンパ組織の機能解析. (2020)
  • 著者名/発表者名: 永石宇司、渡部太郎、渡辺 守
  • 学会等名: 日本応用酵素協会「全身性炎症疾患の病因・病態に関する研究助成」 第9回研究発表会
• [学会発表] IgA-deficiency causes spontaneous enteritis. (2019)
  • 著者名/発表者名: Takahiro Adachi, Taro Watabe, Takashi Nagaishi, Mamoru Watanabe, Hajime Karasuyama, Soichiro Yoshikawa.
  • 学会等名: 第48回日本免疫学会学術集会
  • 国際学会
• [学会発表] BCR signaling in the activated B cells may be regulated by the long isoform of Ceacam1. (2019)
  • 著者名/発表者名: Naoya Tsugawa, Takashi Nagaishi, Daiki Yamada, Yudai Kojima, Taro Watabe, Shuang Wang, Michio Onizawa, Takahiro Adachi, Mamoru Watanabe.
  • 学会等名: 第48回日本免疫学会学術集会
  • 国際学会
• [学会発表] 培養腸上皮幹細胞を用いた炎症性腸疾患に対する再生医療の開発 (2019)
  • 著者名/発表者名: 高橋純一、川井麻央、平栗優衣、竹岡さや香、杉原ハディ優樹、永田紗矢香、竹中健人、齋藤詠子、福田将義、藤井俊光、長堀正和、油井史郎、土屋輝一郎、大塚和朗、渡辺 守
  • 学会等名: 厚生労働科学研究費 難治性疾患政策研究事業 「難治性炎症性腸管障害に関する調査研究」令和元年度 第1回総会
• [学会発表] Analysis of ileocecal immune response in an animal model of colitis. (2019)
  • 著者名/発表者名: Daiki Yamada, Takashi Nagaishi, Taro Watabe, Naoya Tsugawa, Yudai Kojima,Nisha Jose, Akinori Hosoya, Takahiro Adachi, Mamoru Watanabe.
  • 学会等名: International Congress of Mucosal Immunology.
  • 国際学会
• [学会発表] Analysis of APL expression in an animal model of chronic colitis (2019)
  • 著者名/発表者名: Takashi Nagaishi, Yudai Kojima, Taro Watabe, Naoya Tsugawa, Daiki Yamada, Nisha Jose, Akinori Hosoya, Masahiro Suzuki, Michio Onizawa, Mamoru Watanabe.
  • 学会等名: Federation of Clinical Immunology Societies.
• [学会発表] APL downregulation in an animal model of chronic colitis. (2019)
  • 著者名/発表者名: Daiki Yamada, Takashi Nagaishi, Yudai Kojima, Taro Watabe, Naoya Tsugawa, Nisha Jose, Akinori Hosoya, Masahiro Suzuki, Michio Onizawa, Mamoru Watanabe.
  • 学会等名: Asian Organization of Crohn’s and Colitis
  • 国際学会
• [学会発表] Small bowel endoscopic healing of Crohn’s disease treated with anti-TNF antibodies. (2019)
  • 著者名/発表者名: Kento Takenaka, Kazuo Ohtsuka, Toshimitsu Fujii, Kohei Suzuki, Hiromichi Shimizu, Maiko Motobayashi, Shuji Hibiya, Eiko Saito, Masakazu Nagahori, Mamoru Watanabe
  • 学会等名: Asian Organization of Crohn’s and Colitis
  • 国際学会
• [学会発表] The clinical efficacy of ustekinumab (UST) in patients with Crohn’s disease (CD). (2019)
  • 著者名/発表者名: Eiko Saito, Kohei Suzuki, Shuuji Hibiya, Maiko Motobayashi, Kento Takenaka, Nobukatsu Horita, Hiromichi Shimizu, Michio Onizawa, Toshimitsu Fujii, Masakazu Nagahori, Kazuo Ohtsuka, Mamoru Watanabe
  • 学会等名: Asian Organization of Crohn’s and Colitis
  • 国際学会
• [学会発表] 潰瘍性大腸炎罹患粘膜に発生した腫瘍性病変に対するESDの検討. (2019)
  • 著者名/発表者名: 福田将義、永石宇司、根木真理子、大塚和朗、渡辺 守.
  • 学会等名: 第108回日本消化器内視鏡学会関東支部例会
• [学会発表] 慢性大腸炎モデルのT細胞におけるAPLの発現抑制. (2019)
  • 著者名/発表者名: 山田大貴、永石宇司、津川直也、小島裕大、渡部太郎、鈴木雅博、鬼沢道夫、細谷明徳、Jose, Nisha、渡辺 守.
  • 学会等名: 第105回日本消化器病学会総会
• [学会発表] APL expression is downregulated in an animal model of chronic colitis. (2019)
  • 著者名/発表者名: Takashi Nagaishi, Yudai Kojima, Daiki Yamada, Taro Watabe, Naoya Tsugawa, Nisha Jose, Michio Onizawa, Mamoru Watanabe.
  • 学会等名: European Crohn’s and Colitis Organization
  • 国際学会
• [学会発表] 慢性大腸炎モデルにおけるAPL発現の解析. (2019)
  • 著者名/発表者名: 山田大貴、永石宇司、小島裕大、渡部太郎、津川直也、細谷明徳、Jose, Nisha、鈴木雅博、鬼沢道夫、渡辺 守.
  • 学会等名: 第15回日本消化管学会総会学術集会
• [産業財産権] 炎症性腸疾患の治療方法およびそれに用いるための医薬組成物 (2019)
  • 発明者名: 永石宇司
  • 権利者名: 永石宇司
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 2018-554239