2020 年度実施状況報告書

新たに同定されたチオプリン代謝酵素NUDT15のヒト血球内活性測定法の開発

研究課題

研究課題/領域番号	19K08459
研究機関	東北大学
研究代表者	志賀永嗣東北大学, 大学病院, 助教 (20583355)
研究分担者	角田洋一東北大学, 大学病院, 助教 (50509205)
研究期間 (年度)	2019-04-01 – 2022-03-31
キーワード	チオプリン製剤 / 薬物代謝酵素
研究実績の概要	コドン139多型がArg/Arg, Arg/Cys, Cys/Cysである健常人から採取した赤血球検体に対して、6-TGTPを添加しインキュベートさせ、LC/MSで6-TGMP生成量を測定したところ、インキュベート時間が15分、30分、60分、120分それぞれにおいて、Arg/Arg, Arg/Cys, Cys/Cysの順に低下していた。インキュベート時間が15分、60分、120分の時はArg/ArgとCys/Cys間及びArg/CysとCys/Cys間で有意差を認め、インキュベート時間が30分の時にはArg/ArgとCys/Cys間でのみ6-TGMP生成量に有意差を認めた(p＜0.05)。次に、前述の酵素活性測定系での測定値について、日内再現性及び日間再現性の確認を行った。3被験者それぞれにおいて、3日間、1日あたり5回測定し、それぞれの再現性を比較した。コドン139多型がArg/Arg, Arg/Cys, Cys/Cysである健常人から採取した赤血球検体について、日内安定性及び日間安定性を比較するために同一検体を1日あたり5回、3日間、60分間インキュベートを行いLC/MSにて6-TGMP及び6-TGTPを測定したところ、3日間全てCys/Cys-Arg/Cys間、 Cys/Cys-Arg/Arg間における6-TGMP/6-TGTP比で有意な差が認められた(p<0.01)。6-TGMP/6-TGTP比それぞれの最小-最大値は、1日目においてArg/Argは0.155-0.303、Arg/Cysは0.460-0.735、Cys/Cysは0.517-0.915、2日目においてArg/Argは0.289-0.560、Arg/Cysは0.873-1.17、Cys/Cysは0.920-1.46、3日目においてArg/Argは0.203-0.426、Arg/Cysは0.636-1.06、Cys/Cysは0.758-1.35であった。以上のように、同一検体を用いて1日あたり5回、3日間測定したところ、6-TGMP, 6-TGTPのそれぞれの量にばらつきを認めたものの、6-TGMP/6-TGTP比を用いた場合にはほぼ同等の遺伝子型による測定値の違いが確認できた。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由確立された実験系を活用し、酵素活性の測定系の検証が順調に進んでいる。
今後の研究の推進方策	予定通り酵素活性を評価する実際のプロトコルを確定する。酵素活性の測定を実際の臨床現場においてスクリーニング検査として使用することを想定した場合、採血検体をすぐに遠心し冷凍保存することは多くの施設で行うには困難である。一方でコドン139のArg/Cys多型のタンパクは20℃の時点で破壊され不安定な状態になるといわれており、様々な保管条件での検討が必要となることが予想された。そこで、検体採取から実際の測定までの時間・保管方法による測定値の変化について、複数の遺伝子型での検証を行う。また、酵素活性および遺伝子型のいずれがより正確に副作用と相関しているかをより多数検体の測定の下で検証を行う予定である。
次年度使用額が生じた理由	一部の解析が次年度に持ち越しになったため、そのための物品（試薬）の購入に充てる予定である。