| 研究課題/領域番号 |
19K08461
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
小林 正典 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 特任助教 (10825459)
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| 研究分担者 |
柿沼 晴 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (30372444)
土屋 輝一郎 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 准教授 (40376786) [辞退]
大島 茂 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 講師 (50376787)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | ヒトiPS細胞 / 胆管癌 / 疾患モデル / 胆管上皮細胞 |
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| 研究実績の概要 |
研究代表者らは、健常者由来ヒトiPS細胞からヒトiPS細胞由来胆管細胞オルガノイドを用いた疾患モデルを報告してきた。この技術を基盤として、本研究では胆管癌患者、健常者の胆汁検体を採取し、ヒトiPS細胞由来胆管上皮オルガノイドとの共培養系を新規に樹立することで、1)胆汁によってヒト胆管上皮に惹起される細胞内シグナルの差異、2)胆汁内含有物の長期暴露による癌形質獲得の有無、3)胆汁中の発癌物質の同定、を中心課題として胆汁暴露から胆管上皮内部で起きる細胞生理学的な変化と発癌までの病態とを明らかにし、発癌物質を同定することを目的として研究を行い、今年度の成果として下記の成果を得た。
最初に前述の胆管癌患者および健常者に由来する胆汁検体を採取するため、当該施設倫理審査委員会での承認(M2019-069)を得た後、2020年度内にも前年度に引き続いて10例以上、総計20例以上から同意を得て、胆汁を採取した。次に、得られた胆汁とヒトiPS細胞由来胆管上皮オルガノイドとの共培養系を新規に樹立するため、条件検討に着手した。まずは、ヒトiPS細胞由来胆管上皮オルガノイドに対して、タウロコール酸、コール酸などの既知の胆汁成分を添加する系で検証を進めている。胆汁の直接添加系では、高濃度に胆汁を添加すると細胞死が誘導される一方で、一定の濃度で添加した場合は、CCNE1など細胞周期関連分子の発現亢進がみられるなど、いくつかの形質変化が認められており、条件検討を進めつつ、解析を進行している。また今後は1,2-DCPの反応性代謝産物を添加する検討も並行して進める予定である。このようにヒトiPS細胞由来胆管上皮オルガノイドに、胆汁酸を添加した場合とヒト由来胆汁検体を添加した場合との差異について、細胞生物学的、分子生物学的な解析を進行させ、研究の進展を計画している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究方法として、当初の計画では(1)胆汁採取、(2)ヒトiPS細胞由来胆管上皮オルガノイドと胆汁との共培養系の樹立、(3)胆管上皮細胞に起こり得る細胞生理学的変化の解析、(4)胆汁中発癌物質の網羅的解析、(5)胆汁中発癌物質の摂取経路の特定、の5つのステップにわけて立案していた。
このうち今年度は(4)までを行う予定であったが、予定通りの順調な進捗をみせている。 (1)胆汁採取、(2)ヒトiPS細胞由来胆管細胞オルガノイドと胆汁との共培養系の樹立について、予定していた患者からの検体採取も順調に進行し、既に総計で20例以上の検体が入手できている。そしてこれを用いた培養条件の検討を行い、前記のように、胆汁酸成分そのものを添加した場合と胆汁そのものを添加した場合との差異についても、解析が進んでいる。次年度は、本研究をさらに進行させることで、研究を進展できると予測される。
(3)胆管上皮細胞に起こり得る細胞生理学的変化の解析についても、既に条件検討が進んで解析に移っている。胆汁の直接添加系では、高濃度に胆汁を添加すると細胞死が誘導される一方で、一定の濃度で添加した場合は、CCNE1など細胞周期関連分子の発現亢進がみられるなど、いくつかの形質変化が認められている。
(4)胆汁中発癌物質の網羅的解析についても着手し、いくつかの有望な分子に関して、検討を開始している。このように順調に計画が進行しており、次年度も計画の通りに進行させる予定である。(5)胆汁中発癌物質の摂取経路の特定についてもこれらの結果を基盤として進行させる予定であり、今年度までの研究進捗は当初の計画からみて、順調であると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初の研究計画で設定した項目に関して、いずれも今年度の成果に基づいて、研究を進捗させてゆく予定である。 前述の(1)胆汁採取、(2)ヒトiPS細胞由来胆管上皮オルガノイドと胆汁との共培養系の樹立、(3)胆管上皮細胞に起こり得る細胞生理学的変化の解析、の各段階については、今年度と同様に進めることを計画している。(1)についてはとくに肝門部胆管癌患者において、今後も症例数を増やして検討することで、次に述べる(4)の解析にも応用する予定である。(2)と(3)については、条件検討を行いつつ、1次胆汁酸、2次胆汁酸の各成分を添加した際と胆汁そのものを添加した際との比較検討、健常者胆汁と肝門部胆管癌患者胆汁の比較検討を中心に進めて行く予定である。さらに、上記の解析手法で十分な結果が得られなかった場合も想定し、 ゲノム編集によって癌関連遺伝子を修飾したヒトiPS細胞を樹立し、これに胆汁酸あるいは胆汁を添加した際の反応性を検討することで、何らかの知見をえる方法も検討中である。そして、胆管上皮オルガノイドの増殖能、細胞死の評価，既知のIL-33などを含む炎症性サイトカインの産生、LPSによる炎症刺激を加えた際の刺激応答能の評価，共培養によるアポトーシス，ネクロプトーシスの評価について、分子生物学的手法を用 いて詳細に解析を進める予定である。
(4)胆汁中発癌物質の網羅的解析、に関しても今年度の結果を基盤に進行させる予定である。肝門部胆管癌患者と健常者の胆汁を集積し、高速液体クロマトグラフィーによる分離と質量分析による各胆汁成分を網羅的に分析・解析を行う。これを基盤に(5)胆汁中発癌物質の摂取経路の特定も進めて行く予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度使用額が生じた理由: 試薬等が計画当初より廉価で購入可能であったため、廉価な物品を選択して購入したため。 使用計画:検討する数・種類を拡大して解析を発展させて行うため、当初の計画よりも試薬を増量して購入する予定である。
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