研究課題/領域番号 |
19K08470
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研究機関 | 島根大学 |
研究代表者 |
松本 健一 島根大学, 学術研究院医学・看護学系, 教授 (30202328)
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研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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キーワード | テネイシンX / 肝線維化 / LX-2細胞 / フィブリノーゲン様領域 / インテグリンalpha11 beta1 / Hippo/YAP経路 |
研究実績の概要 |
我々はこれまでに、マウスに高リン・高カルシウム・高脂肪食(高リンカルシウム脂肪食)を与えたところ、テネイシンX(TNX)欠損マウスに比べ野生型マウスにおいて、肝線維化が亢進していることを明らかにした。一方、Alcarazらのグループはこれまでに、上皮細胞株において、TNXのフィブリノーゲン様領域(TNX-FBG)が、インテグリンalpha11 beta1 を介してTGF-betaの活性化を誘導することを明らかにした。本年度においては、肝線維化を引き起こすTNX-FBG領域内の関与配列の同定とTNX-FBGを介する細胞内シグナル伝達系を、不死化ヒト肝星細胞株LX-2細胞を用いて、I型コラーゲンalpha1 (COL1A1) mRNAの発現亢進をin vitro線維化の指標として解析を行った。 まず肝線維化を引き起こすTNX-FBG領域の関与配列の同定のために、TNX-FBG領域内の各欠失変異体とインテグリンalpha11をLX-2細胞に強制発現させ、COL1A1 mRNAの発現を検討した。その結果、肝線維化を引き起こすTNX-FBG領域由来の最小アミノ酸領域として、15アミノ酸配列を同定した。 これまでに肝線維化に関与する細胞内シグナル伝達系として、TGF-beta/Smad経路、Hippo/YAP経路、Wnt/beta-Catenin経路が知られている。この3つの経路の内、どの細胞内シグナル伝達系がTNX-FBGが介する肝線維化に関与しているのかを明らかにするために、阻害剤をLX-2細胞に添加し、COL1A1 mRNAの発現を検討した。その結果、Hippo/YAP経路が強く関与し、またTGF-beta/Smad経路は弱く関与することが明らかとなった。一方、Wnt/beta-Catenin経路は関与しないことが明らかとなった。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
肝線維化を引き起こすTNX-FBG領域の関与配列の同定のために、12種類のTNX-FBG領域内欠失変異体の発現クローンを作製し、各TNX-FBG領域内欠失変異体とインテグリンalpha11をLX-2細胞内で強制発現させ、線維化の発現マーカーとして知られているCOL1A1 mRNAの発現を定量PCRにより解析した。その結果、非導入細胞(コントロール)のそれに比べて、最小領域としてTNX-FBG領域由来の15アミノ酸配列を強制発現させたところ、1.79倍のCOL1A1 mRNAの発現亢進が明らかとなった。一方、その最小アミノ酸領域を強制発現させた細胞の培養上清におけるTGF-beta量をELISA分析により解析したところ、コントロールのそれに比べて有意な増加は見られなかった。 次に、肝線維化を引き起こすTNX-FBGを介する細胞内シグナル伝達系を明らかにするために、TNX-FBG領域由来の最小アミノ酸領域とインテグリンalpha11を強制発現させ、線維化に関与することが知られているTGF-beta/Smad経路、Hippo/YAP経路、Wnt/beta-Catenin経路の各阻害剤をLX-2細胞に添加し検討した。その結果、Hippo/YAP経路の阻害剤であるVerteporfinを添加した場合、COL1A1 mRNAの発現が強く抑制され、またTGF-beta/Smad経路の阻害剤であるSB525334を添加した場合は、COL1A1 mRNAの発現が弱く抑制された。一方、Wnt/beta-Catenin経路の阻害剤であるXAV939を添加した場合には、有意なCOL1A1 mRNAの減少は見られなかった。以上のことより、肝線維化を引き起こすTNX-FBGを介する細胞内シグナル伝達系として、Hippo/YAP経路とTGF-beta/Smad経路の関与が示唆された。
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今後の研究の推進方策 |
肝線維化を引き起こす可能性のあるTNX-FBG領域由来の最小アミノ酸領域の15アミノ酸配列を持つペプチド合成し、これをインテグリンalpha11強制発現LX-2細胞に添加し、実際にこのペプチドのみでCOL1A1 mRNAの発現亢進を引き起こせるか否かを調べる。次に、TNX欠損マウスにこのペプチドを投与し、in vivoでの肝線維化への効果を検討する。 また、潜在型TGF-betaとTNX-FBG領域由来15アミノ酸配列とインテグリンalpha11の3者をLX-2細胞に強制発現させることにより、潜在型TGF-betaが活性化され、更なるCOL1A1 mRNAの発現亢進を引き起こすことができるか否かを検討する。 これまでに、肝線維化を引き起こすTNX-FBGを介する細胞内シグナル伝達系として、Hippo/YAP経路がVerteporfinを用いた阻害剤添加実験より明らかとなった。さらにHippo/YAP経路の関与を確認するために、タンパク質レベルでのYAPやリン酸化YAPの量的変動や細胞内局在の変化を検討する。また、YAP siRNAを用いた阻害実験により更なる確証を得ることを試みる。また、弱いながらもTGF-beta/Smad経路の関与もSB525334を用いた阻害剤添加実験により明らかとなったので、同様にタンパク質レベルでのSmad2/3やリン酸化Smad2/3の量的変動や細胞内局在の変化を解析する。 また、野生型マウスとTNX欠損マウスに高リンカルシウム脂肪食を与えた後に肝臓を得、粗タンパク質を抽出する。それを用いて、野生型マウスにおいてはYAP経路やTGF-beta経路が活性化され、一方TNX欠損マウスにおいてはそれらの活性化が抑制されているか否かをタンパク質レベルで検討する。
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次年度使用額が生じた理由 |
(理由)本年度は、LX2細胞を用いてCOL1A1遺伝子の定量PCR法による発現定量により、in vitro線維化の程度を検討したため、主にそれに使用するキット類の購入に経費を費やした。そのため消耗品費の使用額を抑えることができた。次年度は、肝線維化を引き起こすTNX-FBGを介する細胞内シグナル伝達系として、Hippo/YAP経路やTGF-beta/Smad経路をタンパク質レベルで解析するために、抗体類を数多く購入する予定である。 (使用計画)抗体、生化学実験用試薬、TGF-beta定量ELISAキット、染色用試薬、細胞培養用試薬、ディスポーザブルチューブ・チップ・ガラス器具等の消耗品の購入に経費を充てる。また、合成ペプチドの購入、動物実験に必要な器具や試薬の購入、TNX欠損マウスの維持・繁殖に必要な経費 、C57BL/6J野生型マウスの購入費、マウス用高脂肪食餌費に充てる。また、投稿論文の英文校閲費や論文投稿費に充てる。
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