B型肝炎再活性化や発癌の原因となるエンベロープ蛋白質追加糖鎖修飾の分布と機能解析

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K08479
• 研究機関: 愛知医科大学
• 研究代表者: 伊藤 清顕 愛知医科大学, 医学部, 教授 (50551420)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: 糖鎖修飾変異 / HBV再活性化 / 発癌 / エンベロープ蛋白質

研究実績の概要

免疫抑制や化学療法により発症するB型肝炎ウイルス（HBV）の再活性化は、HBVキャリアや日本人の2,500～3,000万人にものぼる既往感染者に発生し得る。HBV再活性化は重症化することが多く、その対策は極めて重要である。また、B型肝炎による肝臓癌はC型肝炎と比較してその発生数が低下しておらず、B型肝炎による肝発癌への対策は十分とは言い難い。最近、海外からHBVエンベロープ蛋白質上の”additional glycosylation”（ここでは追加糖鎖修飾とする）がHBV再活性化や肝発癌症例で高頻度に認められるという報告が相次いでいる。我々はこれまでの本研究事業において、国内のHBV再活性化症例におけるエンベロープ蛋白質の追加糖鎖修飾変異の発現頻度を明らかにした。昨年度はHBVの遺伝子変異をin vitro感染モデルに導入し、遺伝子変異がHBVの増殖やウイルス蛋白質発現および免疫原性に与える影響を解析し、再活性化成立機序のウイルス側要因を解析した。また、肝細胞内のウイルス蛋白質の蓄積や小胞体ストレス等肝癌発生に影響を与える因子を解析し、HBVのエンベロープ蛋白質追加糖鎖修飾による肝発癌発生機序を解析した。今回、我々はin vitro感染モデルにおいて免疫エスケープ変異および追加糖鎖修飾を挿入したHBVを感染させることにより、HBs抗原の免疫原性の低下およびHBV DNAの分泌増加を誘導しHBVの潜伏感染の状態を再現することによりHBV再活性化発生のハイリスクとなるウイルス側要因を明らかにした。In vitro感染モデルにおける肝発癌機序の解析において、免疫エスケープ変異および追加糖鎖修飾を挿入したHBV感染により予想された小胞体ストレスの上昇は認められず、今後他のgenotypeを使用したHBV constructの作製およびin vivo感染モデルへの移行を計画した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

我々は、in vitro感染モデルを使用して遺伝子操作によりウイルス変異を挿入し、エンベロープ蛋白質の追加糖鎖修飾変異がHBV再活性化や肝発癌に与える影響を解析した。具体的にはgenotype A由来のHBV constructに免疫エスケープ変異であるG145R変異および追加糖鎖修飾変異であるM133T変異を遺伝子操作により挿入し（遺伝子組み換え実験大臣承認済み）、肝癌由来のHuh7細胞やHepG2細胞およびヒト新鮮肝細胞であるPXB細胞を用いたin vitro感染モデルを使用して分泌されるHBV DNAやHBs抗原を測定し、HBV再活性化のウイルス側の発生機序を解析した。その結果、G145R変異単独でもHBs抗原の免疫原性は低下するが、G145R+M133Tの二重変異においてはその免疫原性はさらに低下することを明らかにした。また、免疫原の低下はA社、B社、C社という3社の自動免疫測定装置で測定した結果、それぞれの測定法により免疫原性は異なり、B社の自動免疫測定装置でHBs抗原の免疫原性が最も低下していた。また、発癌に与える影響を解析するため、PXB細胞にそれぞれの変異を挿入したHBVを感染させ、PXB細胞の小胞体ストレスを測定した。その結果、EDEM1、BiP、XBP1、CHOPといった小胞体ストレスに関連する因子に変化を認めなかった。今後は別のジェノタイプ由来のconstructを作成して解析することおよび他の発癌機構として肝発癌に関与すると報告されているGnT-IIIやV等の糖転移酵素の活性を測定する予定とした。エンベロープ蛋白質に過剰な糖鎖が結合することにより、血管新生や細胞増殖につながり発癌を惹起する糖転移酵素 の活性が上昇している可能性がある。

今後の研究の推進方策

これまで我々は、in vitro感染モデルとしてHBV genotype A由来のconstructを作成して解析に使用してきた。これまでの成果としてHBV再活性化のウイルス側の因子に関しては発生機序に迫ることができた。しかし、肝発癌に関しては追加糖鎖修飾変異による肝発癌への影響は明らかとなっていない。そこで、今後はHBVの中でも肝発癌を高率に引き起こすgenotype C由来のconstructを作成してそれぞれ免疫エスケープ変異、糖鎖修飾変異を挿入することにより、in vitro感染モデルにおいて発癌に関連する小胞体ストレスや酸化ストレスに関連する因子を解析する。また、in vivo感染モデルとしてヒト肝細胞を移植したPXBマウスに免疫エスケープ変異と追加糖鎖修飾変異を挿入したHBVを感染させることにより肝臓内の癌や前癌病変の発生の有無を観察する。また、病変の出現がなくてもマイクロアレイを用いて肝組織中の遺伝子発現の変化を比較し、がん遺伝子やがん抑制遺伝子の変化を解析し発癌機構を解明する。

次年度使用額が生じた理由

In vitro感染モデルによるHBV再活性化機序の解明が予定より効率的に実施することができたため、次年度のin vivo感染モデルでの使用を計画した。

研究成果

• [雑誌論文] Mutations in the envelope protein associated with hepatitis B virus reactivation (2021)
  • 著者名/発表者名: Ito Kiyoaki
  • 雑誌名: Hepatol Research 巻: 51 ページ: 151-153
  • DOI: 10.1111/hepr.13619
  • 査読あり
• [雑誌論文] ステロイドや免疫抑制薬使用中のde novo B型肝炎予防と発症後の対処 (2021)
  • 著者名/発表者名: 伊藤清顕
  • 雑誌名: medicina 巻: 58 ページ: 410-414
• [雑誌論文] Screening siRNAs against host glycosylation pathways to develop novel antiviral agents against hepatitis B virus (2020)
  • 著者名/発表者名: Ito Kiyoaki、Angata Kiyohiko、Kuno Atsushi、Okumura Akinori、Sakamoto Kazumasa、Inoue Rieko、Morita Naoko、Watashi Koichi、Wakita Takaji、Tanaka Yasuhito、Sugiyama Masaya、Mizokami Masashi、Yoneda Masashi、Narimatsu Hisashi
  • 雑誌名: Hepatology Research 巻: 50 ページ: 1128～1140
  • DOI: 10.1111/hepr.13552
  • 査読あり
• [雑誌論文] Pilot study of tenofovir disoproxil fumarate and pegylated interferon-alpha 2a add-on therapy in Japanese patients with chronic hepatitis B (2020)
  • 著者名/発表者名: Matsumoto A, Nishiguchi S, Enomoto H, Tanaka Y, Shinkai N, Okuse C, Kang JH, Matsui T, Miyase S, Yatsuhashi H, Nagaoka S, Kanda T, Enomoto M, Yamada R, Hiramatsu N, Saito S, Takaguchi K, Ito K, Masaki T, Morihara D, Tsuge M, Chayama K, Ikeda F, Kagawa T, Kondo Y, Murata K, Tanaka E
  • 雑誌名: Journal of Gastroenterology 巻: 55 ページ: 977～989
  • DOI: 10.1007/s00535-020-01707-6
  • 査読あり
• [雑誌論文] Virological Factors Associated with the Occurrence of HBV Reactivation in Patients with Resolved HBV Infection Analyzed through Ultradeep Sequencing (2020)
  • 著者名/発表者名: Sakamoto Kazumasa、Umemura Takeji、Ito Kiyoaki、Okumura Akinori、Joshita Satoru、Ota Masao、Sugiyama Masaya、Mizokami Masashi、Yoneda Masashi、Tanaka Eiji
  • 雑誌名: The Journal of Infectious Diseases 巻: 14 ページ: 400-407
  • DOI: 10.1093/infdis/jiz478
  • 査読あり
• [雑誌論文] B型肝炎再活性化発症に関連するウイルス側因子 (2020)
  • 著者名/発表者名: 伊藤清顕、梅村武司、坂本和賢、奥村彰規、田中榮司、米田政志
  • 雑誌名: 肝臓 巻: 61 ページ: 237-239
  • 査読あり