新規クローン病特異的抗体の対応抗原を探索する

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K08481
• 研究機関: 久留米大学
• 研究代表者: 光山 慶一 久留米大学, 医学部, 教授 (20200066)
• 研究分担者: 山崎 博 久留米大学, 医学部, 助教 (20529565) ; 吉岡 慎一郎 久留米大学, 医学部, 助教 (90425190)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: ACP353 / TCP353 / AIEC / クローン病 / バイオマーカー

研究実績の概要

1) 各種E.coli株を溶解し、ウェスタンブロット法でACP353抗体との反応性確認した。その結果、いずれも多数のバンドが見られるが、AIECに特異的なものは判別できなかった。さらに抗原であるTCP353ペプチドを添加して吸収実験を実施したが、特に変化はみられなかったことから、ほぼ全て非特異反応と推察された。
2) THP-1から分化誘導したマクロファージ様細胞に各種E.coli株を感染させ、ウェスタンブロット法でACP353抗体との反応性を確認したが、非常に弱いシグナルのバンドが数本見られるのみで、AIEC特異的なものはみられなかった。さらにTCP353ペプチドを添加して吸収実験を実施したが、変化はみられなかった。次に各種サイトカイン産生の測定すると、IL-6とTNF-α産生が増加したが、コントロール（JM105）とAIECでは差異はなかった。さらにTCP353ペプチド添加による各種サイトカイン産生への影響を検討すると、TCP353ペプチドの添加によりIL-6とTNF-αの増加はみられなかったが、AIEC感染細胞ではTCP353ペプチド濃度依存的に、IL-6とTNF-α産生はむしろ減少した。JM105感染細胞ではほとんど変化はなかった。
今回の結論として、本実験系ではSW480細胞へのAIECの結合は、コントロール（JM105）と比較して高いことは観察されたが、細胞内でのAIEC増殖が再現されなかった。また菌体、感染細胞を用いて、ACP353抗体によるウェスタンブロットを実施したが、特徴的なシグナルは見られらなかった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

ホモロジー検索でのアプローチとしては、クローン病では、自己抗原だけでなく、腸内の共生細菌や真菌の抗原、および食物抗原に対する免疫寛容が破綻していると言われているため、生物種を限定せずにCXXGLFPN配列にてホモロジー検索を実施し、ヒット配列の中から、腸内の共生細菌や真菌の抗原、および食物抗原を抽出することを試みた。しかしながら、ヒット数が多いため、作業は容易ではなかった。そこで、ヒト由来のペプチドNo.125（CSLGLFPN）を参考にしてのホモロジー検索も実施した。
その結果、クローン病患者血清が強く反応するCXXGLFPN配列は、ヒト、共生細菌、寄生虫由来のタンパク質中に存在することが分かった。また、上記の配列の中で飛びぬけて反応性の良いものはないため、いずれもACP353の真の対応抗原ではなく、単に交差反応性を有しているだけの可能性は残る。
さらに別のアプローチとして、TCP353とその対応抗原の候補であるAIECとの関連を調べた。まず、通気性または嫌気性培養した各種E.coli株とACP353抗体との反応性確認として、a) ウェスタンブロット法と、b) 菌体固相化プレートとACP353抗体とのEIAを実施した。
次に、THP-1から分化誘導したマクロファージ様細胞に各種E.coli株を感染させ、a) マクロファージ／E.coliを溶解し、ウェスタンブロット法でACP353抗体との反応性確認、b) 各種サイトカイン産生の測定、およびc) TCP353ペプチド添加による各種サイトカイン産生への影響についても検討した。

今後の研究の推進方策

TCP353のホモロジー検索による検討では、オリジナルのTCP353よりもクローン病患者検体と強く反応する配列が複数見つかったのは収穫であったが、ACP353の対応抗原をズバリ同定するには至っていない。クローン病では、自己抗原だけでなく、腸内の共生細菌や真菌の抗原、および食物抗原に対する免疫寛容が破綻していると言われている。したがって、ヒト以外の生物種由来のタンパク質がACP353の対応抗原かもしれなく、その場合、まだデータベースに登録されていない可能性もありうる。以上から、これまで検討したアミノ酸配列の中で飛びぬけて反応性の良いものはないため、いずれもACP353の真の対応抗原ではなく、単に交差反応性を有しているだけの可能性は残る。対応抗原の同定はかなり難易度の高い作業と考えられるが、今後も丹念に検討を続けていく予定である。
TCP353とその対応抗原の候補であるAIECについての追加実験としては、今後、健常人またはCD、UC患者由来のPBMCに各種E.coli株を感染させて各種解析を行い、AIEC感染により腸炎を発症したマウスの血清中にACP353が検出されるか等を検討していく予定である。
これまでに得られている結果はACP353と腸管免疫との関係を示唆しているようにも考えられる。ACP353とAIECとの関連が証明できれば、ACP353を、将来出てくるであろうAIECを標的とした治療を選択するための診断薬にできるかもしれない。

次年度使用額が生じた理由

TCP353とその対応抗原の候補であるAIECとの関連を調べるために、まず通気性または嫌気性培養した各種E.coli株とACP353抗体との反応性確認のため、a) ウェスタンブロット法と、b) 菌体固相化プレートとACP353抗体とのEIAを実施した。
次に、THP-1から分化誘導したマクロファージ様細胞に各種E.coli株を感染させ、a) マクロファージ／E.coliを溶解し、ウェスタンブロット法でACP353抗体との反応性確認、b) 各種サイトカイン産生の測定、および c) TCP353ペプチド添加による各種サイトカイン産生への影響についても検討した。いずれにおいても、単一の感染時間だけでは、予想通りの結果が得られず、感染時間等を延長する追加実験が必要であった。

研究成果

• [雑誌論文] Diagnostic accuracy of serum proteinase 3 antineutrophil cytoplasmic antibodies in children with ulcerative colitis (2021)
  • 著者名/発表者名: Tatsuki Mizuochi,Katsuhiro Arai,Takahiro Kudo,Ryusuke Nambu,Hitoshi Tajiri,Tomoki Aomatsu,Naoki Abe,Toshihiko Kakiuchi,Kunio Hashimoto,Tsuyoshi Sogo,Michiko Takahashi,Yuri Etani,Yugo Takaki,Ken-Ichiro Konishi,Jun Ishihara,Hitoshi Obara,Tatsuyuki Kakuma,Shunsuke Kurei,Yushiro Yamashita,Keiichi Mitsuyama
  • 雑誌名: Journal of Gastroenterology and Hepatology 巻: 36 ページ: 1538-1544
  • DOI: 10.1111/jgh.15296
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Therapeutic Potential of a Self-Assembling Peptide Hydrogel to Treat Colonic Injuries Associated with Inflammatory Bowel Disease (2021)
  • 著者名/発表者名: Araki T, Mitsuyama K, Yamasaki H, Morita M, Tsuruta K, Mori A, Yoshimura T, Fukunaga S, Kuwaki K, Yoshioka S, Takedatsu H, Kakuma T, Akiba J, Torimura T.
  • 雑誌名: Journal of Crohn's and Colitis 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1093/ecco-jcc/jjab033
  • 査読あり
• [雑誌論文] Evaluation of Serum Luecine-rich Alpha-2 Glycoprotein as a New Inflammatory Biomarker of Inflammatory Bowel Disease (2021)
  • 著者名/発表者名: Yoshimura T, Mitsuyama K, Sakemi R, Takedatsu H, Yoshioka S, Kuwaki K, Mori A, Fukunaga S, Araki Y, Morita M, Tsuruta K, Yamasaki H, Torimura T
  • 雑誌名: Mediators of Inflammation 巻: 8825374 ページ: 1-10
  • DOI: 10.1155/2021/8825374
  • 査読あり
• [雑誌論文] Altered serum profile of the interleukin-22 system in inflammatory bowel disease (2020)
  • 著者名/発表者名: Sakemi R, Mitsuyama K, Morita M, Yoshioka S, Kuwaki K, Tokuyasu H, Fukunaga S, Mori A, Araki T, Yoshimura T, Yamasaki H, Tsuruta K, Morita T, Yamasaki S, Mizoguchi A, Sou S, Torimura T
  • 雑誌名: Cytokine 巻: 136 ページ: 155264
  • DOI: 10.1016/j.cyto.2020.155264
  • 査読あり
• [雑誌論文] Leukocyte Apheresis Using a Fiber Filter Suppresses Colonic Injury Through Calcitonin Gene-Related Peptide Induction (2020)
  • 著者名/発表者名: Yamasaki H, Mitsuyama K, Yoshioka S, Kuwaki K, Yamauchi R, Fukunaga S, Mori A, Tsuruta O, Torimura T
  • 雑誌名: Inflammatory bowel diseases 巻: 11 ページ: 709-719
  • DOI: 10.1093/ibd/izz303
  • 査読あり
• [雑誌論文] Clinical Features and Pathogenic Mechanisms of Gastrointestinal Injury in COVID-19 (2020)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Mitsuyama, Kozo Tsuruta, Hidetoshi Takedatsu, Shinichiro Yoshioka, Masaru Morita, Mikio Niwa, Satoshi Matsumoto
  • 雑誌名: Journal of Clinical Medicine 巻: 9 ページ: 3630
  • DOI: 10.3390/jcm9113630
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Highly bioavailable curcumin derivative ameliorates Crohn's disease symptoms: A randomized, double-blind, multicenter study (2020)
  • 著者名/発表者名: Sugimoto K, Ikeya K, Bamba S, Andoh A, Yamasaki H, Mitsuyama K, Nasuno M, Tanaka H, Matsuura A, Kato M, Ishida N, Tamura S, Takano R, Tani S, Osawa S, Nishihira J, Hanai H
  • 雑誌名: Journal of Crohns & Colitis 巻: 14 ページ: 1693-1701
  • DOI: 10.1093/ecco-jcc/jjaa097
  • 査読あり
• [雑誌論文] Safety and efficacy of single-needle leukocyte apheresis (LCAP) for treatment of ulcerative colitis (2020)
  • 著者名/発表者名: Shindo Y, Mitsuyama K, Yamasaki H, Imai T, Yoshioka S, Kuwaki K, Yamauchi R, Yoshimura T, Araki T, Morita M, Tsuruta K, Yamasaki S, Fukami K, Torimura T
  • 雑誌名: Therapeutic Apheresis and Dialysis 巻: 24 ページ: 503-510
  • DOI: 10.1111/1744-9987.13539
  • 査読あり
• [雑誌論文] Gene Expression of Transient Receptor Potential Channels in Peripheral Blood Mononuclear Cells of Inflammatory Bowel Disease Patients (2020)
  • 著者名/発表者名: Morita T, Mitsuyama K, Yamasaki H, Mori A, Yoshimura T, Araki T, Morita M, Tsuruta K, Yamasaki S, Kuwaki K, Yoshioka S, Takedatsu H, Torimura T
  • 雑誌名: Journal of Clinical Medicine 巻: 9 ページ: 2643
  • DOI: 10.3390/jcm9082643
  • 査読あり
• [雑誌論文] 【特集Ⅰ：臓器相関の中枢としての消化管の役割を考える】 血液疾患に伴う消化器疾患のトピックス (2020)
  • 著者名/発表者名: 鶴田耕三、荒木俊博、森田 俊、吉村哲広、森 敦、森田 拓、山嵜紗代、桑木光太郎、吉岡慎一郎、竹田津英稔、光山慶一
  • 雑誌名: 消化器・肝臓内科 巻: 8 ページ: 322-328
• [雑誌論文] IL-10/IL-10受容体遺伝子異常症 (2020)
  • 著者名/発表者名: 桝 忠宏、水落建輝、光山慶一
  • 雑誌名: 消化管症候群（第3版）Ⅲ-その他の消化管疾患を含めて- 巻: 3 ページ: 242-245
• [学会発表] 日本から発信するIBD研究. 潰瘍性大腸炎に対する新規治療薬としてのCGRPの効果の検討 (2020)
  • 著者名/発表者名: 山崎 博、荒木俊博、光山慶一
  • 学会等名: 第11回日本炎症性腸疾患学会学術集会（JSIBD）
• [学会発表] 慢性大腸炎モデルに対する青黛の有効性と作用機序についての検討 (2020)
  • 著者名/発表者名: 森田 俊、鶴田耕三、荒木俊博、吉村哲広、山崎 博、桑木光太郎、吉岡慎一郎、竹田津英稔、光山慶一、鳥村拓司
  • 学会等名: 第11回日本炎症性腸疾患学会学術集会（JSIBD）
• [学会発表] ラット大腸潰瘍モデルにおける自己組織化ハイドロゲルの効果とその機序 (2020)
  • 著者名/発表者名: 荒木俊博、山崎 博、森田 俊、鶴田耕三、吉村哲広、桑木光太郎、吉岡慎一郎、竹田津英稔、光山慶一
  • 学会等名: 第11回日本炎症性腸疾患学会学術集会（JSIBD）
• [学会発表] 炎症性腸疾患における血清LRG測定の有用性についての検討 (2020)
  • 著者名/発表者名: 酒見亮介、吉岡慎一郎、森田 拓、森田 俊、鶴田耕三、森 敦、吉村哲広、荒木俊博、桑木光太郎、宗 祐人、光山慶一、鳥村拓司
  • 学会等名: 第11回日本炎症性腸疾患学会学術集会（JSIBD）
• [学会発表] 日本から発信するIBD研究. 潰瘍性大腸炎に対するアドレノメデュリン療法の開発医師主導全国多施設共同二重盲検治験（第Ⅱa相） (2020)
  • 著者名/発表者名: 山本隆行、芦塚伸也、北 俊弘、大宮直木、金井隆典、本谷 聡、平井郁仁、仲瀬裕志、森山智彦、中村正直、鈴木康夫、上村修司、小林 拓、日比紀文、大井秀久、野崎良一、光山慶一、山本章二郎、渡辺孝二、北村和雄
  • 学会等名: 第11回日本炎症性腸疾患学会学術集会（JSIBD）
• [学会発表] Tight Controlの実践とその課題. 炎症性腸疾患診療におけるLeucine-rich Alpha-2 Glycoproteinと血清Calprotectinを用いた非侵襲的な粘膜活動性モニタリングの可能性 (2020)
  • 著者名/発表者名: 吉岡慎一郎、酒見亮介、荒木俊博、鶴田耕三、森田 俊、吉村哲広、森 敦、桑木光太郎、竹田津英稔、光山慶一
  • 学会等名: 第11回日本炎症性腸疾患学会学術集会（JSIBD）
• [学会発表] クローン病患者における適切な手術適応とタイミング (2020)
  • 著者名/発表者名: 衣笠哲史、光山慶一、藤田文彦、赤木由人
  • 学会等名: 第75回日本大腸肛門病学会学術集会
• [学会発表] IBDに合併した肛門病変への対応. 小児クローン病患者の肛門病変に対する外科的治療の経験 (2020)
  • 著者名/発表者名: 衣笠哲史、溝部智亮、水落建輝、光山慶一、藤田文彦、赤木由人
  • 学会等名: 第45回日本大腸肛門病学会九州地方会、第36回九州ストーマリハビリテーション研究会
• [学会発表] 肝免疫と微細環境. 新規血清バイオマーカーを活動性指標とした炎症性腸疾患治療への試み (2020)
  • 著者名/発表者名: 吉岡慎一郎、酒見亮介、光山慶一、荒木俊博、鶴田耕三、森田 俊、吉村哲広、森 敦、山内亨介、桑木光太郎、鳥村拓司
  • 学会等名: 第57回日本消化器免疫学会総会
• [学会発表] 超拡大内視鏡とAIが潰瘍性大腸炎関連腫瘍のサーベイランスに有用であった一例 (2020)
  • 著者名/発表者名: 福永秀平、草場喜雄、荒木俊博、長 知徳、中根智幸、永田 務、大内彬弘、向笠道太、秋葉 純、光山慶一、鶴田 修、鳥村拓司
  • 学会等名: 第115回日本消化器病学会九州支部例会 第109回日本消化器内視鏡学会九州支部例会 合同
• [学会発表] IBD special situationにおける諸問題（消化器病・内視鏡）.当院における炎症性腸疾患合併妊娠の現状と問題点 (2020)
  • 著者名/発表者名: 吉岡慎一郎、山内亨介、荒木俊博、鶴田耕三、森田 俊、吉村哲広、森 敦、桑木光太郎、光山慶一、鳥村拓司
  • 学会等名: 第115回日本消化器病学会九州支部例会 第109回日本消化器内視鏡学会九州支部例会 合同