ネクロプトーシスシグナル異常を標的とした心不全治療の開発

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K08544
• 研究機関: 札幌医科大学
• 研究代表者: 矢野 俊之 札幌医科大学, 医学部, 講師 (40444913)
• 研究分担者: 丹野 雅也 札幌医科大学, 医学部, 准教授 (00398322) ; 久野 篤史 札幌医科大学, 医学部, 准教授 (30468079)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: 心不全 / ネクロプトーシス / 心筋細胞

研究実績の概要

心不全の病態形成におけるネクロプトーシスの関与を検討するために臨床研究を行った。

方法：心筋生検を施行された拡張型心筋症57例（56±15歳，男性 68%）を対象とした．ネクロプトーシス活性化の指標として，生検標本の免疫染色により解析したリン酸化MLKL（p-MLKL）の発現量を用いた． p-MLKL発現量の中央値を用いて，発現量高値群と低値群に分類した．全死亡および心不全・心室性不整脈による再入院をイベントと定義した．結果：p-MLKLは，心筋細胞の細胞質，介在版および核に発現していた．核p-MLKL発現量は三尖弁圧較差（TRPG，r=0.317）と正に，僧帽弁輪部拡張早期波（e’，r=-0.327）と負に，介在板p-MLKL発現量は平均左室壁厚（r=-0.374）と負に相関していた．中央値3.6年の観察期間における無イベント生存率は，核p-MLKL高値群では低値群と比較して有意に低値であり（4% vs. 31%, p=0.021 by the log-rank test），この関係は背景因子（年齢，性別，BNP，e’，TRPG）をpropensity score matchingにより調整後も同様に観察された．一方，介在板p-MLKL高値群と低値群では無イベント生存率に有意差がなかった．結語：以上の結果から，核でのリン酸化MLKL発現増加が，拡張型心筋症症例の不良な予後と関係している可能性が示唆された．

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

臨床研究は概ね順調に進行しており、最近申請者らが報告したオートファジーとの関連を解析する予定としている。
基礎研究では、マウスおよびラットのリン酸化MLKLを検出する抗体が見つかったため、今年度解析を予定している。

今後の研究の推進方策

MLKL細胞内局在の変化がネクロプトーシスおよび心筋代謝に与える影響の検討
a)生後3日齢のラット心室から単離した初代心筋細胞とH9c2心筋芽細胞を用いる。ネクロプトーシスを誘導するために、TNF (50 ng/ml)とカスパーゼ抑制薬(z-VAD-fmk: zVAD, 20uM)の同時投与(TNF/zVAD)を用いる。ネクロプトーシスの指標として、培養液中のLDH活性と細胞溶解液におけるRIP1とRIP3の結合レベル及びMLKLのリン酸化を用いる。さらにMLKL siRNAを用いたMLKL発現抑制により遮断されるか否かを評価する。TNF/zVAD刺激によるネクロプトーシスシグナル誘導がリン酸化MLKL(Ser368)の細胞内局在に与える影響を免疫染色もしくは過剰発現系を用いて解析する。MLKLの核移行シグナル阻害による細胞質型MLKL過剰発現および核外輸送シグナル阻害による核型MLKL過剰発現系を作成し、ネクロプトーシスとの関連を解析する。核型MLKL過剰発現系における遺伝子発現の変化をDNAアレイを用いて解析する。

心不全動物モデルにおけるネクロプトーシスの役割
拡張型心筋症マウスモデルを用いる。心エコーとコンダクタンスカテーテルで評価した左室形態及び左室機能を指標に代償期心不全と左室機能が低下した非代償期心不全の週齢を明確にする。in vivoにおけるネクロプトーシスの指標としてリン酸化MLKLとC9の免疫染色を用いる。心不全代償期と非代償期におけるリン酸化MLKLの細胞内局在、C9で検出したネクローシス、さらに核型MLKLによる制御される心筋代謝物を解析し、心不全の非代償化とネクロプトーシスの関連を検討する。mTORC1阻害薬とネクロプトーシス阻害薬(necrostatin-1)を投与し、心不全改善効果と下流の標的分子の関連性を明確にする。

次年度使用額が生じた理由

基礎実験の実験が計画通りに遂行できずに物品費に残額がでた。次年度の物品費として使用したい。

研究成果

• [雑誌論文] Utility of the sarcopenia index for assessment of muscle mass and nutritional status in patients with chronic heart failure: Comparison with anthropometric parameters. (2020)
  • 著者名/発表者名: Abe K, Yano T, Katano S, Ohori H, Ishigo T, Moniwa N, Miura T.
  • 雑誌名: Geriatr Gerontol Int 巻: 20 ページ: 388-389
  • DOI: 10.1111/ggi.13876
  • 査読あり
• [雑誌論文] Assessment of prognosis in immunoglobulin light chain amyloidosis patients with severe heart failure: a predictive value of right ventricular function. (2020)
  • 著者名/発表者名: Nagano N, Yano T, Fujita Y, Kouzu H, Koyama M, Ikeda H, Yasui K, Muranaka A, Nishikawa R, Takahashi R, Kishiue N, Yuda S, Miura T.
  • 雑誌名: Heart Vessels 巻: 35 ページ: 521
  • DOI: 10.1007/s00380-019-01513-y.
  • 査読あり
• [雑誌論文] mTORC1 inhibition attenuates necroptosis through RIP1 inhibition-mediated TFEB activation. (2020)
  • 著者名/発表者名: Abe K, Yano T, Tanno M, Miki T, Kuno A, Sato T, Kouzu H, Nakata K, Ohwada W, Kimura Y, Sugawara H, Shibata S, Igaki Y, Ino S, Miura T.
  • 雑誌名: Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis 巻: 1865 ページ: 165552
  • DOI: 10.1016/j.bbadis.2019.165552
  • 査読あり
• [雑誌論文] Vanishing Cardiac Tumor: Cardiac Involvement in Methotrexate-Associated Lymphoproliferative Disorders. (2019)
  • 著者名/発表者名: Kishiue N, Yano T, Koyama M, Nishikawa R, Nagano N, Kouzu H, Kokubu N, Kawamura R, Muranaka A, Kikuchi S, Tsuchida A, Miura T.
  • 雑誌名: Circ Cardiovasc Imaging 巻: 12 ページ: e009689
  • DOI: 10.1161/CIRCIMAGING.119.009689
  • 査読あり
• [雑誌論文] Utility and safety of tocilizumab in Takayasu arteritis with severe heart failure and muscle wasting. (2019)
  • 著者名/発表者名: Yano T, Osanami A, Shimizu M, Katano S, Nagano N, Kouzu H, Koyama M, Muranaka A, Harada R, Doi H, Kawaharada N, Miura T.
  • 雑誌名: ESC Heart Fail 巻: 6 ページ: 894
  • DOI: 10.1002/ehf2.12487
  • 査読あり
• [雑誌論文] Postpartum heart failure complicated with thyroiditis: A concealed aggravator of peripartum cardiomyopathy? (2019)
  • 著者名/発表者名: Kouzu H, Yano T, Nagano N, Koyama M, Ogawa T, Fujita Y, Muranaka A, Miura T.
  • 雑誌名: Can J Cardiol 巻: 35 ページ: 796.e1
  • DOI: 10.1016/j.cjca.2019.03.013
  • 査読あり
• [雑誌論文] Canagliflozin, a sodium-glucose cotransporter 2 inhibitor, normalizes renal susceptibility to type 1 cardiorenal syndrome through reduction of renal oxidative stress in diabetic rats. (2019)
  • 著者名/発表者名: Kimura Y, Kuno A, Tanno M, Sato T, Ohno K, Shibata S, Nakata K, Sugawara H, Abe K, Igaki Y, Yano T, Miki T, Miura T.
  • 雑誌名: J Diabetes Investig. 巻: 10 ページ: 933-946
  • DOI: 10.1111/jdi.13009.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Empagliflozin, an SGLT2 Inhibitor, Reduced the Mortality Rate after Acute Myocardial Infarction with Modification of Cardiac Metabolomes and Antioxidants in Diabetic Rats. (2019)
  • 著者名/発表者名: Oshima H, Miki T, Kuno A, Mizuno M, Sato T, Tanno M, Yano T, Nakata K, Kimura Y, Abe K, Ohwada W, Miura T.
  • 雑誌名: J Pharmacol Exp Ther 巻: 368 ページ: 524-534
  • DOI: 10.1124/jpet.118.253666.
  • 査読あり
• [学会発表] Activation of necroptotic pasthway by downregulated caspase-8 expression is associated with progression of left ventricular remodeling in nonischemic dilated cardiomyopathy. (2019)
  • 著者名/発表者名: Fujita Y, Yano T, Abe K, Nagano N, Kamiyama N, Fujito T, Mochizuki A, Koyama M, Kouzu H, Muranaka A, Nagahara D, Tanno M, Miki T, Miura T.
  • 学会等名: ESC congress 2019
  • 国際学会
• [学会発表] Inhibitory phosphorylation of RIP1 at Ser320 induces nuclear translocation of TFEB, leading to suppression of necroptosis in cadiomyocytes. (2019)
  • 著者名/発表者名: Abe K, Yano T, Sato T, Kouzu H, Kuno A, Tanno M, Miki T, Miura T.
  • 学会等名: ESC congress 2019
  • 国際学会
• [学会発表] Low energy intake predicts readmission of elderly heart failure patients independently of nutritional status. (2019)
  • 著者名/発表者名: Shimomura K, Katano S, Yano T, Ohori K, Honma S, Watanabe A, Ishigo T, Fujito T, Nagano N, Koyama M, Kouzu H, Hashimoto A, Miura T.
  • 学会等名: ESC congress 2019
  • 国際学会
• [学会発表] Impact of body composition analysis on prediction of short-term readmission events in heart failure: muscle wasting vs. obesity. (2019)
  • 著者名/発表者名: Ohori K, Yano T, Katano S, Honma S, Shimomura K, Watanabe A, Ishigo T, Fuito T, Nagano N, Koyama M, Kouzu H, Hashimoto A, Miura T.
  • 学会等名: ESC congress 2019
  • 国際学会
• [学会発表] Reduced level of caspase-8, an endogenous inhibitor of necroptosis, is associated with left ventricular enlargement in dilated cardiomyopathy. (2019)
  • 著者名/発表者名: Fujita Y, Yano T, Nagano N, Kamiyama N, Fujito T, Mochizuki A, Koyama M, Kouzu H, Muranaka A, Nagahara D, Tanno M, Miki T, Miura T.
  • 学会等名: 第83 回日本循環器学会年次学術集会
• [学会発表] mTORC1 活性阻害はRIP1 の抑制的リン酸化により心筋細胞のネクロプトーシスを抑制する (2019)
  • 著者名/発表者名: 矢野俊之, 安部功記, 佐藤達也, 神津英至, 久野篤史, 丹野雅也, 三木隆幸, 三浦哲嗣
  • 学会等名: 第40 回 日本循環制御医学会総会・学術集会
• [学会発表] シンポジウム: 心筋生検overview ～見えないものまで見る～ (2019)
  • 著者名/発表者名: 矢野俊之
  • 学会等名: 第55 回 日本小児循環器学会総会・学術集会
  • 招待講演
• [学会発表] 高齢心不全患者のトータルマネージメント: 高齢心不全における筋消耗規定因子の解明：サルコペニアを標的とした 心不全治療の開発に向けて (2019)
  • 著者名/発表者名: 矢野俊之, 片野唆敏, 神津英至, 三浦哲嗣
  • 学会等名: 第67 回 日本心臓病学会学術集会
• [学会発表] Distinct expressions of caspase-8 and phospho-MLKL, necroptosis regulatory proteins, in nonischemic dilated cardiomyopathy. (2019)
  • 著者名/発表者名: Fujita Y, Yano T, Abe K, Nagano N, Nishikawa R, Kamiyama N, Fujito T, Mochizuki A, Koyama M, Kouzu H, Muranaka A, Nagahara D, Tanno M, Miki T, Miura T.
  • 学会等名: 第23 回 日本心不全学会学術集会
• [学会発表] Impact of activation of necroptotic signaling on mitochondrial dynamics in cardiomyocytes. (2019)
  • 著者名/発表者名: Yano T, Ong S, Sato T, Kouzu H, Kuno A, Tanno M, Miki T, Miura T.
  • 学会等名: CVMW2019 心血管代謝週間