| 研究課題/領域番号 |
19K08611
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
瀬山 邦明 順天堂大学, 医学部, 教授 (10226681)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | リンパ脈管筋腫症 / 細胞外小胞 / mTORシグナル / リンパ管新生 / 形質転換 |
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| 研究実績の概要 |
実際のLAM病巣でphenotype transferが生じていることを確認するため、1例のLAM患者の乳び胸水から分離したLAM細胞クラスター（LCC）について、LCCの免疫染色とTSC2変異を検討した。免疫染色では、リンパ管内皮細胞（LEC）以外のLCCを構成するほとんどの細胞はLAM細胞に矛盾しない染色結果だったが、TSC2変異のallelic frequencyは20％弱であり、何らかのメカニズムによりLCC内でphenotype transferが起こっていることは改めて確認できた。
LAM患者に合併する乳び胸水から分離した細胞外小胞（EVs）によるphenotype transferについては、ヒト肺組織から分離した初代培養線維芽細胞を用いて検討した。ヒト肺線維芽細胞は肺癌患者の摘出肺の非癌部からFACSで上皮細胞、内皮細胞を除いた細胞集団を間葉系細胞として分離し、培養した。①LAM患者由来の乳び胸水そのもの、②乳び胸水由来のEVs、および③LAM移植肺由来間葉系細胞の培養上清から採取したEVsを、それぞれ初代培養ヒト肺線維芽細胞へ添加してPhenotype transferが起きるのか検討した。異なる3例の肺癌患者の非癌部から初代培養ヒト肺線維芽細胞を準備し、①、②、③を培養上清に添加して細胞形態の変化を観察したが乳び液そのものを添加した際にのみ線維芽細胞の細胞質が大きくなって増殖が早くなる傾向をみとめた。しかし、乳び液中には多種類の増殖因子やサイトカインが含まれることが予想され、特にTGF-βが間葉系細胞に上記のような細胞形態の変化を及ぼすことが考えられたため、抗TGF-β抗体を乳び液とともにヒト肺線維芽細胞に添加して観察したところ、線維芽細胞の形態や増殖には変化が見られなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
LAM病巣内でphenotype transferが起きていることは間違いないが、乳び液中のEVs、LAM移植肺由来間葉系細胞の培養上清から採取したEVsを用いても、初代培養ヒト肺線維芽細胞にLAM細胞様の形態変化を起こさせることができなかった。乳び液を直接用いた実験では、形態変化が誘導できるため、原因として培養上清に添加しているEVs量が少ないという可能性を考えたが、EVsではなく乳び液中に含まれる増殖因子等の影響による差であると結論した。LAM病巣内で起こっているphenotype transferのメカニズムの一つとしてEVsが確実に関与していると思えるエビデンスが得られていないため、（4）遅れている、と判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
乳び液や血清から分離したEVsを用いin vitroで直接、細胞形態を変化させることを観察することは困難であると感じている。そこで、研究費の残額も少ないことを考慮し、3年目は乳び胸水と血清から分離した各EVsから分離したmiRNAの網羅的発現解析を行い、その結果をin silicoで解析し、LAM細胞特有の蛋白質発現を誘導しうる候補miRNAを同定することを目標とする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
少額のため購入できる試薬がなかった。
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