胸膜中皮腫の予後改善を目指した診断マーカーと阻害化合物の探索

2021 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K08668
• 研究機関: 愛知医科大学
• 研究代表者: 細川 好孝 愛知医科大学, 医学部, 教授 (60229193)
• 研究分担者: 太田 明伸 愛知医科大学, 医学部, 講師 (30438048)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: 悪性胸膜中皮腫 / 癌抑制遺伝子 / 遺伝子編集技術 / cDNAマイクロアレイ

研究実績の概要

・悪性胸膜中皮腫はアスベスト曝露に関連して発症し、2000年から2039年までの40年間で患者の死亡者数は10万人を超えると予測されている。多くは進行した状態で診断され、化学療法や免疫チェックポイント阻害薬の併用療法が行われているが、その効果は極めて限定的である。悪性中皮腫では、癌抑制遺伝子であるp16INK4a ，NF2 ， BAP1に不活化変異が高頻度に検出される。本研究では、胸膜中皮細胞を用いて癌抑制遺伝子ノックアウト株を作成し、中皮腫の増殖・浸潤・転移に関わる細胞内分子および阻害化合物を同定し、新規診断マーカーや新規治療薬の候補分子を探索した。
・我々は、cDNAマイクロアレイ網羅的発現解析とリアルタイムPCR解析によって、NF2ノックアウト株で高発現する遺伝子としてFGF受容体2を同定した。FGF受容体2抗体を用いた組織アレイ解析では、中皮腫23検体中で9検体が陽性を示し、FGF受容体2が診断バイオマーカーのための有望な候補であることを示した。
・次に、NF2/p16 ダブルノックアウト細胞株を樹立し、CD24遺伝子が特異的に高発現していることを見出した。CD24抗体を用いた組織アレイ解析では、中皮腫45検体中で34検体が陽性を示し、FGF受容体2と共にCD24が新たな診断バイオマーカーの候補であることを示した。さらに、ダブルノックアウト細胞株を用いて400個小分子化合物ライブラリーのスクリーニングを行い、脂肪酸合成酵素阻害剤が特異的な細胞増殖抑制効果を示すことを見出した。
・癌抑制遺伝子BAP1のノックアウト細胞株の樹立に成功した。
将来的には中皮腫に対する効果的な診断法・治療法を開発することを目指す。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

・cDNAマイクロアレイ網羅的発現解析とリアルタイムPCR解析によって、NF2ノックアウト株で高発現する遺伝子としてFGF受容体2を同定し、FGF受容体2抗体を用いた組織アレイ解析では、中皮腫23検体中で9検体が陽性を示し、FGF受容体2が診断バイオマーカーのための有望な候補であることを示すことができた。
・NF2/p16 ダブルノックアウト細胞株を樹立し、CD24遺伝子が特異的に高発現していることを見出し、さらに、CD24抗体を用いた組織アレイ解析で、FGF受容体2と共にCD24が新たな診断バイオマーカーの候補であることを示すことができた。さらに、ダブルノックアウト細胞株を用いて400個小分子化合物ライブラリーのスクリーニングを行い、脂肪酸合成酵素阻害剤が特異的な細胞増殖抑制効果を示すことを見出すことができた。
以上より、本研究課題はおおむね順調に進展していると自己評価した。

今後の研究の推進方策

・愛知県がんセンター、近畿医科大学、兵庫医科大学の研究チームと連携し、中皮腫患者検体を用いたFGF受容体2 およびCD24による免疫組織染色の規模を拡大して実施する。中皮腫特異的な染色が確認できれば、次に患者血清や胸水を用いたELISA法及びCLEIA 法を確立し、新たな早期診断の開発を目指す。
・400個の小分子化合物ライブラリーのスクリーニングを行い、NF2/p16 ダブルノックアウト細胞株で腫瘍特異的な細胞増殖抑制効果を示す脂肪酸合成酵素阻害剤を発見した。がん細胞では脂肪酸合成が亢進しており、脂肪酸合成の亢進ががん細胞の増殖に関与していることが明らかになってる。今回発見した脂肪酸合成酵素阻害剤による細胞増殖抑制効果の分子基盤を明らかにしていく。また、他の脂肪酸合成酵阻害剤でも効果を検討する。
・中皮腫で高頻度に不活化している癌抑制遺伝子BAP1のノックアウト株を準備し、MTTアッセイによる細胞増殖を指標として、まず400個小分子化合物ライブラリーを用いたスクリーニングを行う。将来的には、東京大学の創薬機構に所蔵される小分子化合物ライブリーの取得を申請し、約1～2万種類の化合物からシーズ探索を計画する。
・中皮腫の病態を細胞レベルから個体レベルで解析するため、樹立した細胞株を種々の免疫不全マウスに移植し、マウス造腫瘍能について検討する。癌抑制遺伝子ノックアウト株の移植に成功すれば、細胞レベルで確認された生物学的特性を個体レベルで検証することが可能となる。また、細胞レベルでスクリーニングされた化合物の効果を個体レベルで検討することも可能となる。

次年度使用額が生じた理由

現在までの進捗状況に記載があるとおり、使用した経費内で研究計画はおおむね順調に達成された。次年度使用額は、新たに樹立した癌抑制遺伝子BAP1ノックアウト株の分子生物学的解析に利用する。

研究成果

• [雑誌論文] Phosphorylation and Suppresses Migration and Invasion With CDH1 Stabilization in Colorectal Cancer (2022)
  • 著者名/発表者名: Akira Koshino , Aya Nagano , Akinobu Ota , Toshinori Hyodo, Akane Ueki , Masayuki Komura , Akane Sugimura-Nagata , Masahide Ebi , Naotaka Ogasawara , Kenji Kasai , Yoshitaka Hosokawa , Kunio Kasugai , Satoru Takahashi , Shingo Inaguma
  • 雑誌名: Front Pharmacol 巻: 12 ページ: -
  • DOI: 10.1038/s41598-021-01978-w
• [雑誌論文] CD52 is a novel target for the treatment of FLT3-ITD-mutated myeloid leukemia (2021)
  • 著者名/発表者名: S Karnan , I Hanamura , A Ota , S Takasugi , A Nakamura , M Takahashi , K Uchino , S Murakami , Md Wahiduzzaman , L Q Vu , Md L Rahman , M N Hasan , T Hyodo , H Konishi , S Tsuzuki , K Yoshikawa , S Suzuki , R Ueda , Mi Ejiri , Y Hosokawa , A Takami
  • 雑誌名: Cell Death Discovery 巻: 7 ページ: 121
  • DOI: 10.1038/s41420-021-00446-8
• [雑誌論文] Flow cytometry-based quantification of targeted knock-in events in human cell lines using a GPI-anchor biosynthesis gene PIGP (2021)
  • 著者名/発表者名: Md Lutfur Rahman , Toshinori Hyodo , Muhammad Nazmul Hasan , Yuko Mihara , Sivasundaram Karnan , Akinobu Ota , Shinobu Tsuzuki , Yoshitaka Hosokawa , Hiroyuki Konishi
  • 雑誌名: Biosci Rep 巻: 41 ページ: -
  • DOI: 10.1042/BSR20212231