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2019 年度 実施状況報告書

尿細管上皮の間葉転換を制御するタンパク質架橋修飾の役割

研究課題

研究課題/領域番号 19K08675
研究機関名古屋大学

研究代表者

辰川 英樹  名古屋大学, 創薬科学研究科, 助教 (10565253)

研究期間 (年度) 2019-04-01 – 2022-03-31
キーワード上皮間葉転換 / タンパク質架橋酵素 / トランスグルタミナーゼ / 腎線維化 / 尿細管上皮細胞
研究実績の概要

腎線維化は組織に細胞外マトリクスが過剰に蓄積し、正常な機能が失われる疾患である。腎線維化の病態初期では、腎尿細管上皮細胞の上皮間葉転換(EMT)や細胞死が病態形成の起点として考えられている。これまでの研究により、病態初期においてこのような尿細管上皮細胞の形質転換が、皮膚型のタンパク質架橋酵素トランスグルタミナーゼ(TG1)により制御されることを見出しており、この分子機構の解明を目指し、本年度は以下の3つの点について実験を実施した。<BR>
① 尿細管上皮細胞株HK-2を播種し、TG1に特異的なsiRNAを用いて遺伝子発現を抑制した後にTGF-βやH2O2処理によるEMTや細胞死を誘導したところ、TG1は上皮細胞に対して保護的に働き、同一ファミリーの別のアイソザイムであるTG2はTGF-βの作用因子として働くことが示された。
② TGF-βやH2O2処理したHK-2に架橋酵素のリジン残基側の基質であるビオチン標識一級アミンBPAを添加して、EMTや細胞死誘導時においてTGase活性により取り込まれるBPA修飾タンパク質の経時的な変化を検出した。EMTや細胞死誘導処理の12時間後にBPA修飾タンパク質が増大したことから、EMTや細胞死の誘導に伴いTGaseの活性が上昇し、特定のタンパク質を基質として架橋することにより、EMTや細胞死誘導機構を制御することが示唆された。今後はこれらのBPA修飾タンパク質を精製し、網羅的な同定解析を目指す。
③ TG1の全身欠損マウスは表皮の形成異常により致死性であるため、Creレコンビナーゼにより時期や細胞種特異的にTG1を欠損することが可能なTG1flox/flox 変異マウスをCRISPRにより作製した。現在、同マウスとタモキシフェンにより制御可能なCreERT2もしくは尿細管特異的に発現するgGT-Creの変異マウスと掛け合わせを進めている。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

尿細管上皮細胞での表皮型タンパク質架橋酵素の実態解明のために提案した以下の点についての進捗状況を示す。<BR>
架橋酵素の発現・活性化が尿細管上皮細胞のEMTおよび細胞死において、in vitro実験でのおおよそどのタイミングで発現・活性が上昇するのかについて情報を得た。また、架橋酵素の活性化に伴い修飾されるビオチン化ペンチルアミン(BPA)を指標として、特定の時期に特異的なバンドが増加することを見出した。架橋酵素が発現・活性化する制御機構については、詳細な解析がまだ出来ていないものの、上記の内容を加味して、概ね順調に進展していると考える。<BR>
TG1を時期・細胞特異的に欠損するためのTG1flox/floxマウスについては、CRISPRを用いて既に作製済みであるため、当初の計画以上に実験が進展している。

今後の研究の推進方策

TGF-βもしくはH2O2処理した尿細管上皮細胞において、EMTおよび細胞死を誘導する際の架橋酵素の発現・活性化の経時的変化については検証済みであり、今後は同条件において、EMTや細胞死のシグナル伝達機構の特定、プロテオーム解析による架橋される基質タンパク質の網羅的同定を行っていく。<BR>
Creレコンビナーゼ誘導性のTG1欠損マウスについても既に作製済みであり、早期に対象のCreマウスとの掛け合わせが終了する見込みであるため、完成した変異マウスを用いて腎線維化の病態モデルを誘導し、順次表現型解析を進めていく。

次年度使用額が生じた理由

進捗状況に記載したように、尿細管上皮細胞株のEMTおよび細胞死の実験系の確立に時間がかかり、実験状況から架橋酵素活性の経時的変化の検証実験を優先させたため、活性化機構に関する実験は実施しなかった。このため、研究費の一部を次年度に繰り越した。

  • 研究成果

    (27件)

すべて 2020 2019 その他

すべて 雑誌論文 (5件) (うち査読あり 5件) 学会発表 (20件) (うち国際学会 3件) 図書 (1件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] Analysis of the expression of transglutaminases in the reconstructed human epidermis using a three-dimensional cell culture2020

    • 著者名/発表者名
      Teshima Hirofumi、Kato Manami、Tatsukawa Hideki、Hitomi Kiyotaka
    • 雑誌名

      Analytical Biochemistry

      巻: - ページ: 113606~113606

    • DOI

      doi: 10.1016/j.ab.2020.113606

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Transglutaminase orthologues in medaka fish - biochemical characterization and establishment of gene-deficient mutants2020

    • 著者名/発表者名
      Meng Qi、Watanabe Yuko、Suzuki Risa、Oguri Rina、Tatsukawa Hideki、Hitomi Kiyotaka
    • 雑誌名

      Analytical Biochemistry

      巻: - ページ: 113610~113610

    • DOI

      doi: 10.1016/j.ab.2020.113610

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Identification and characterization of substrates crosslinked by transglutaminases in liver and kidney fibrosis2020

    • 著者名/発表者名
      Tatsukawa Hideki、Takeuchi Taishu、Shinoda Yoshiki、Hitomi Kiyotaka
    • 雑誌名

      Analytical Biochemistry

      巻: - ページ: 113629~113629

    • DOI

      doi: 10.1016/j.ab.2020.113629

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Gene disruption of medaka (Oryzias latipes) orthologue for mammalian tissue-type transglutaminase (TG2) causes movement retardation2020

    • 著者名/発表者名
      Watanabe Yuko、Okuya Kazuho、Takada Yuki、Kinoshita Masato、Yokoi Saori、Chisada Shinichi、Kamei Yasuhiro、Tatsukawa Hideki、Yamamoto Naoyuki、Abe Hideki、Hashimoto Hisashi、Hitomi Kiyotaka
    • 雑誌名

      The Journal of Biochemistry

      巻: - ページ: mvaa038

    • DOI

      doi: 10.1093/jb/mvaa038

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Studies on differentiation‐dependent expression and activity of distinct transglutaminases by specific substrate peptides using three‐dimensional reconstituted epidermis2019

    • 著者名/発表者名
      Tanabe Yuki、Yamane Miki、Kato Manami、Teshima Hirofumi、Kuribayashi Miki、Tatsukawa Hideki、Takama Hiroyuki、Akiyama Masashi、Hitomi Kiyotaka
    • 雑誌名

      The FEBS Journal

      巻: 286 ページ: 2536~2548

    • DOI

      10.1111/febs.14832

    • 査読あり
  • [学会発表] ヒト表皮の分化に気相培養を必須とするメカニズムの研究2019

    • 著者名/発表者名
      手島裕文、加藤まなみ、辰川英樹、人見清隆
    • 学会等名
      生化学会中部支部例会
  • [学会発表] モデル生物としてのメダカを用いた血液凝固因子トロンビンの発現解析と変異体作製2019

    • 著者名/発表者名
      鈴木里沙、Meng Qi, 渡辺優子、人見清隆
    • 学会等名
      生化学会中部支部例会
  • [学会発表] 腎線維化において架橋修飾される新規基質タンパク質の同定と解析2019

    • 著者名/発表者名
      辰川英樹、人見清隆
    • 学会等名
      日本腎臓学会
  • [学会発表] Analysis of the mechanism of transglutaminase-mediated tissue fibrosis2019

    • 著者名/発表者名
      辰川英樹、竹内大修、人見清隆
    • 学会等名
      Gordon Research Conferences Tissue Repair and Regeneration
    • 国際学会
  • [学会発表] Studies on cellular changes upon air-liquid phase stimulation in the three-dimensional keratinocyte culture system2019

    • 著者名/発表者名
      手島裕文、栗林美樹、伊藤帆南、辰川英樹、人見清隆
    • 学会等名
      Gordon Research Conferences Barrier function
    • 国際学会
  • [学会発表] Detection system of transglutaminase in vitro and in situ activities using specific substrate peptides in the epidermis and three-dimensional keratinocyte cultured system2019

    • 著者名/発表者名
      加藤まなみ、手島裕文、田辺勇輝、辰川英樹、人見清隆
    • 学会等名
      Gordon Research Conferences Barrier function
    • 国際学会
  • [学会発表] Biochemical characterization of medaka thrombin, a blood coagulation factor, and establishment of its gene-deficient fish2019

    • 著者名/発表者名
      小栗莉奈、 鈴木里沙、Meng Qi、小栗莉奈、 渡辺優子、辰川英樹、橋本寿史、人見清隆
    • 学会等名
      小型魚類研究会
  • [学会発表] Investigation for Medaka Orthologues of Human Fibrinogen2019

    • 著者名/発表者名
      Meng, Qi、鈴木里沙、小栗莉奈、 渡辺優子、辰川英樹、橋本寿史、人見清隆
    • 学会等名
      小型魚類研究会
  • [学会発表] タンパク質の架橋による翻訳後修飾反応を介した組織線維化の分子メカニズムの解析2019

    • 著者名/発表者名
      辰川英樹、人見清隆
    • 学会等名
      92回日本生化学会大会
  • [学会発表] 胚線維化におけるタンパク質架橋化酵素の病態生理学的意義の解析2019

    • 著者名/発表者名
      竹内大修、辰川英樹、人見清隆
    • 学会等名
      92回日本生化学会大会
  • [学会発表] 表皮立体培養細胞系を用いた タンパク質架橋化酵素群の機能解析2019

    • 著者名/発表者名
      加藤まなみ、手島裕文、栗林美樹、山口央輝、辰川英樹、人見清隆
    • 学会等名
      92回日本生化学会大会
  • [学会発表] マウスの胎生段階における表皮形成と羊水成分の変動解析2019

    • 著者名/発表者名
      栗林美樹、手島裕文、加藤まなみ、辰川英樹、人見清隆
    • 学会等名
      日本農芸化学会関西中部合同支部例会
  • [学会発表] 肺線維症に寄与するタンパク質架橋化酵素の役割2019

    • 著者名/発表者名
      竹内大修、桑田啓子、辰川英樹、人見清隆
    • 学会等名
      日本農芸化学会関西中部合同支部例会
  • [学会発表] モデル生物としてのメダカを用いた血液凝固における架橋化酵素と活性化因子トロンビンの研究2019

    • 著者名/発表者名
      鈴木里沙、 Meng Qi, 渡辺優子、人見清隆
    • 学会等名
      日本農芸化学会関西中部合同支部例会
  • [学会発表] メダカを用いた血液凝固因子トロンビンの欠損個体作製による機能解析2019

    • 著者名/発表者名
      鈴木里沙、 Meng,、Qi 、 渡辺優子、辰川英樹、橋本寿史、人見清隆
    • 学会等名
      ゼブラフィッシュ・メダカ創薬研究会
  • [学会発表] Establishment of Fibrinogen Knockout Medaka (Oryzias latipes) Aiming to Investigate itsNovel Function and Drug Screening2019

    • 著者名/発表者名
      Qi Meng,、鈴木里沙、小栗莉奈、 渡辺優子、辰川英樹、橋本寿史、人見清隆
    • 学会等名
      ゼブラフィッシュ・メダカ創薬研究会
  • [学会発表] Studies on epidermal differentiation by air-liquid interface stimulation in three-dimensional culture2019

    • 著者名/発表者名
      手島裕文、栗林美樹、辰川英樹、人見清隆
    • 学会等名
      日本研究皮膚科学会年次学術大会・総会
  • [学会発表] 表皮細胞分化に気相培養を必須とするメカニズムの解析2019

    • 著者名/発表者名
      手島裕文、栗林美樹、伊藤帆南、加藤まなみ辰川英樹、人見清隆
    • 学会等名
      分子生物学会大会
  • [学会発表] Structural and Biochemical Investigation of amostatic Factor Fibrinogen Using Medaka (Oryzias lateipes)2019

    • 著者名/発表者名
      Qi Meng,、鈴木里沙、小栗莉奈、 渡辺優子、辰川英樹、橋本寿史、人見清隆
    • 学会等名
      分子生物学会大会
  • [学会発表] マウスの胎生段階における表皮形成と羊水成分の変動解析胎生進行に伴う表皮形成レベルと羊水成分の変動解析2019

    • 著者名/発表者名
      栗林美樹、手島裕文、山口央輝、辰川英樹、人見清隆
    • 学会等名
      分子生物学会大会
  • [図書] 食品・バイオにおける最新の酵素利用 井上國世 監修2019

    • 著者名/発表者名
      手島裕文、加藤まなみ、辰川英樹、人見清隆
    • 総ページ数
      208-214
    • 出版者
      シーエムシー出版
  • [備考] 名古屋大学大学院創薬科学研究科 細胞生化学分野 Website

    • URL

      http://www.ps.nagoya-u.ac.jp/lab_pages/biochemistry/newpage2.html

URL: 

公開日: 2021-01-27  

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