| 研究課題/領域番号 |
19K08676
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
加藤 規利 名古屋大学, 医学部附属病院, 病院講師 (90716052)
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| 研究分担者 |
前田 佳哉輔 名古屋大学, 医学部附属病院, 病院助教 (00836306)
丸山 彰一 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (10362253)
古橋 和拡 名古屋大学, 医学部附属病院, 助教 (50835121)
勝野 敬之 愛知医科大学, 医学部, 准教授 (60642337)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | マイクロRNA / 核酸医薬 / エクソソーム |
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| 研究実績の概要 |
治療のプラットフォームとして従来の低分子化合物から、2000年代以降には新しく抗体医薬が多数開発され、関節リウマチや悪性新生物の分野で広く応用され患者の治療の仕組みが大きく変わって来たという事実がある。今後の新しい治療薬として、細胞治療に加え核酸医薬が挙げられている。核酸医薬は比較的安価に合成でき、一度定めた投与法を用い、配列の変更などを行うことで、様々な疾患に応用可能な治療薬として注目を集めている。我々も生体内に存在する自然のRNAi機構であるmicroRNA(miRNA)の治療的応用に着目し、過去においてPolyethylenimine (PEI)をドラッグデリバリーシステムとして用い、NF-κBを負に制御するmiR-146aを投与することで、敗血症モデルマウスの高サイトカイン血症を抑制、生存率を改善させる事に成功してきた。miR-146aに治療効果があることがわかった一方で、敗血症治療のターゲットの一つとして脾臓が重要な役割を持つことが判明した。
次に投与法としてPEIを全身投与という形で用いた核酸のデリバリーを行ってきたが、PEI自体に免疫賦活化作用があることから、PEIだから有効性が確認されたのか、他のデリバリーシステムがより有益なのかの検証が必要である。背景として炎症部位にはリポソームが適しているという報告は多数ある。また昨今では細胞外小胞であるエクソソームもドラッグデリバリーに優れているという報告も相次いでいる。
今回は核酸のデリバリー方法として、PEI、リポソーム、エクソソームを用い、投与方法としても全身投与、ターゲット臓器としての脾臓直接投与を行うことで、敗血症に対する治療効果を検証する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
我々の先行研究においては、NF-κBの下流シグナルを抑制するmiR-146aの発現ベクターを用いてきた。昨今ゾルゲンスマといった遺伝子導入治療が臨床に応用されるようになり、治療法のプラットフォームとしてベクターを用いることは容認されるが、敗血症モデルは急性疾患であり、目的細胞（この場合脾臓マクロファージ）に取り込まれ、効果を発揮させるためにモデル作成前に投与する必要があった。
以上のような背景から、臨床的にも応用できるよう即効性を持たせるため、今回は治療物質としてmiR-146a発現ベクターではなく、mature miR-146aを用いることとした。また投与経路を経静脈的全身投与、および効果臓器としての脾臓直接投与を行った。脾臓直接投与に関しては、先行実験を参照にPEIをデリバリーシステムとして利用し投与したmiRNAの大部分が脾臓に留まり、一部門脈を介してと考えられる肝臓にも確認された。また同様に先行研究で明らかになったmiR-146aの脾臓マクロファージへの取り込みに関しても、F4/80による脾臓細胞のセレクションにより証明した。盲腸結紮穿孔（CLP）モデルにおいてBUN, Cr, LDHといった臓器障害のパラメーターはscramble配列と比較しても改善傾向をみたが、non-treatと比較すると核酸投与自体が障害を助長しており、治療的介入により十分な改善効果が確認できなかった。次に脂質二重膜を形成するリポソームを用いてmature miR-146aを経腹膜投与、経静脈的に投与し治療効果を評価した。現在までのところで、両投与経路で評価した限りにおいて、死亡率に関し優位な治療効果を示せていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
マウス盲腸結紮穿孔モデルは、盲腸穿孔による細菌感染、腹腔内局所への炎症細胞浸潤、リンパ節における抗原提示、全身のサイトカインストームといった一連の敗血症の経過を模すことができ、実際の臨床状況に即した反応が得られるメリットがあるが、もとより手技的なバラツキが大きなモデルであり、以前の我々の報告の際と術者が変わったこともあり安定的な障害を起こせていない実情がある。そのため敗血症モデルを、より安定的なLPS腹腔内注射モデルに変更して治療実験を継続する。
投与経路に関しては、直接的な脾臓内投与に特徴を見出していたが、治療効果は一部に認めるものの物理的な侵襲が高く、応用にはハードルがある。以上により（１）mature miR-146a+PEI, （２）mature miR-146a+リポソーム, （３）人工核酸miR-146a+PEI, （４）人工核酸miR-146a+リポソームの各群で頚静脈投与を行い、治療効果を確認する。特に後者の人工核酸に関しては生体内での安定性が高く、より強い効果があると言われる。実際にin vitroの系において、一部マウスマクロファージ細胞株に対しLPS刺激を行った際の、IL6等炎症性サイトカイン反応を、天然核酸より強く抑制したというデータが得られている。投与タイミングにおいても、早期に投与すると腹腔内の感染、菌血症に対する炎症の初期反応が抑制されてしまう可能性があり、いままでモデル作成直後に投与してきたが、１２時間もしくは２４時間投与をずらすことで、晩期の過剰な免疫応答を抑える事を期待して条件ふりをしていく。
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