| 研究課題/領域番号 |
19K08685
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
長田 太助 自治医科大学, 医学部, 教授 (40393194)
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| 研究分担者 |
前嶋 明人 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (70431707)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 腎間質線維化 / Nrf2-KEAP1 / 血管内皮細胞 / Bardoxolone methyl / 腎尿細管 |
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| 研究実績の概要 |
慢性腎臓病が進行し，末期腎不全に至る過程で尿細管間質の線維化が重要である．傷害された尿細管細胞が放出するTGFβなどにより，線維化が増悪する．Bardoxolone methyl (CDDO-Me)が推定糸球体濾過率 (eGFR)を上昇させたとの臨床における報告があるが，CDDO-MeがNrf2-KEAP1系の活性化を介して種々の抗酸化的酵素の転写を上昇させることが知られているものの，その機序は解明されていない．これまで以下の2つを目標に研究を進めた．1)in vitroの培養系において血管内皮のNrf2活性化が，anti-fibrotic factorの産生を増加させるのかを確認し，その責任分子を同定する．2)血管内皮および尿細管特異的Nrf2 knock out マウスを作成し，片側尿管結紮モデル(UUO)による間質線維化が対照マウスよりも増強するか検討し，血管内皮もしくは尿細管，どちらのNrf2が腎間質線維化に重要なのかを明らかにする．当初，血管内皮特異的なマウスだけを作製して解析しようとしていたが，経過中に尿細管特異的なPax8-Cre/Nrf2-floxマウスも入手できたので，同時に研究を進めることとなった．1)の責任分子の同定はマウスの供給状況の関係で2）を先行させることとしたので，現在保留中であり，時期を見て再開予定である．2）に関連して，Wild typeのマウスでの検討ではUUOによる腎間質線維化は有意にCDDO-Me投与で抑制された．現在Tie2-Cre/flox-Nrf2とPax8-Cre/flox-Nrf2の2系統のを現在増殖中であり，必要な匹数が確保でき次第，2)を明らかにするための実験を開始する．その結果を確認後，CDDO-Me投与ではそれが改善しないかを検討し，CDDO-meのNrf2活性化による抗線維化作用の特異性を示す予定である．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
1)の血管内皮のNrf2活性化により増加するanti-fibrotic factorを示すためにsiRNAを用いて培養内皮細胞のNrf2をknock downする予定で準備をしていたが，既報，もしくは市販のsiRNAを複数種類試したが，十分なNrf2のknock downを確認することができなかった．昨年度ようやくTie2-Cre/flox-Nrf2マウス（flox-Nrf2がhomo）がようやく生まれ始めたので，これの個体を増やす予定である．この腎臓からマイクロビーズを用いた血管内皮の単離を施行し，これを培養した上でマイロアレイ解析を施行し，anti-fibrotic factor同定を目指すことにした．この方法では多数の腎臓が必要であり，現在2)の実験を優先させているので，こちらの実験は2)で必要なマウスが用意でき次第開始することにしている．2)血管内皮および尿細管特異的Nrf2 knock out マウスを作成し，片側尿管結紮モデル(UUO)による間質線維化が対照マウスよりも増強するか検討するため，現在Tie2-Cre/flox-Nrf2とPax8-Cre/flox-Nrf2の2系統のを増殖中である．実験できるレベルの匹数をそろえるのに時間がかかっているが，必要数に達し次第，開始する予定である．
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| 今後の研究の推進方策 |
1)は，Tie2-Cre/flox-Nrf2マウスの腎臓から血管内皮を単離・培養して用い，対照としてはwild typeとflox-Nrf2マウスの腎臓からそれぞれ血管内皮を単離・培養したものを用いる．CDDO-Meと対照としてDMSO（溶媒）でover-night刺激したそれぞれの培養細胞の上清を遠心した後，上澄みをCut-Off limit 3.5 kDaの透析カセットで透析してCDDO-Meを除き，さらに遠心式限外濾過フィルタで容量を減じた後，それをNIH-3T3細胞の培養液に混じ，TGFβ 2.5ng/mLで20hr刺激する．それぞれのNIH-3T3細胞をreal time PCRに供することにより，collagen Iα1の転写程度を比較し，CDDO-Meで誘導されたanti-fibrotic factorの発現増加がNrf2依存的かを示す．それを確かめた後，wild type, flox-Nrf2, Tie2-Cre/flox-Nrf2，3種類の培養血管内皮細胞でCDDO-Me刺激後に発現増加する遺伝子のうち，Nrf2依存的なものをマイクロアレイ解析で絞り込むことが可能になる．2）に関しては，Tie2-Cre/flox-Nrf2,およびPax8-Cre/flox-Nrf2マウスが十分の匹数を確保でき次第，UUOモデルを作成する予定である．対照マウス(Wild type, flox-Nrf2)と比べてTie2-Cre/flox-Nrf2もしくはPax8-Cre/flox-Nrf2マウスでは間質線維化が増強するものの，CDDO-Me投与によって改善しないことを確かめる．当初は虚血再還流(IR)モデルも並行して作成する予定であったが，予定が遅れているのでUUOモデルを優先的に実施することにした．UUOモデルの結果の確認後，IRモデルについての実施も考慮する．
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