| 研究課題/領域番号 |
19K08690
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| 研究機関 | 昭和大学 |
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研究代表者 |
本田 一穂 昭和大学, 医学部, 教授 (10256505)
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| 研究分担者 |
康 徳東 昭和大学, 医学部, 助教 (00571952)
高木 孝士 昭和大学, 大学共同利用機関等の部局等, 講師 (10774820)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 血管内皮 / グリコキャリックス / 糖鎖 / シアル酸 / ゲムシタビン |
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| 研究実績の概要 |
令和3年度は研究者の諸事情により研究を進展させることが出来ず，新たな研究成果は得られていない。そのため，研究期間を延長し、本研究の目的につながる研究知見を得ていく所存である。ここでは令和2年度までに得られた研究実績をまとめ，今後の研究推進方策を明らかにしたい。
令和１年度は培養内皮細胞（HUVEC）のグリコキャリックス(GCX)を蛍光色素で描出し共焦点レーザー顕微鏡で観察する方法を確立した。これにより内皮GCXの厚さの評価やGCX糖鎖の末端シアル酸の結合状態を評価することが可能となった。シアル酸は内皮細胞の表面分子である血小板内皮細胞間接着因子（PECAM, CD31)，血管内皮カドヘリン(VE-Cad)，血管内皮成長因子受容体2（VEGFR2) の糖鎖に付加されており，細胞内シグナル伝達を介して内皮の様々な機能を調節している。したがって，内皮GCXの末端シアル酸の制御機構を明らかにすることは，内皮機能を強化し血管を保護する治療を開発する上で重要なことが推察された。
それを基に令和2年度は，抗癌剤のゲムシタビン(GEM)を内皮に添加する実験系を確立し，GEMにより内皮GCXの糖鎖末端シアル酸が減少することで，内皮細胞の結合性低下や変性が誘導されることが示された。さらにその減少機序として，シアル酸分解酵素（sialidase）の発現は不変なるもシアル酸合成酵素であるST6Gal-Iの減少することが観察され，ゴルジ体におけるシアル酸合成が傷害されるとの知見を得ている。
これらの研究業績を基に，今後は内皮細胞のGCXの糖鎖末端シアル酸表出の制御機構についてin vitroの実験系を用いてさらに探索し，本研究の目的である「内皮グリコキャリックス強化を戦略とする内皮保護療法の開発」のための手がかりを得たいと考えている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
今年度は研究者の事情（研究を実施する大学院生の異動や研究代表者の多忙により研究時間が確保できなかったことなど）により，研究を遂行することが出来なかった。そのため，研究費も運用していない。研究期間を1年間延長とし，次年度で研究を遂行する所存である。当初の計画では，内皮グリコキャリックス（GCX）の形態学的描出と構成要素の解析を培養細胞を用いたin vitroの実験系と内皮GCXが傷害される糖尿病マウスを用いたin vivoの実験系の両面から内皮GCXを強化する血管保護療法を探索する予定であったが，コロナ禍による動物実験施設の閉鎖や大学業務の多忙で実施できなかった。残りの研究期間では，本研究の目的の達成に少しでも迫り，かつ将来の研究に役立つ知見を得るために，研究手法は培養内皮細胞を用いたin vitroの実験系に絞って，内皮GCXと内皮細胞の機能の関連性を明らかにする研究を行う予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまで，培養内皮細胞(HUVEC)を用いて，抗癌剤ゲムシタビンに(GEM)よる内皮グリコキャリック(GCX)の変化を誘導するin vitroの実験系を確立した。GCXの描出はレクチン蛍光染色で行い，共焦点レーザー顕微鏡で描出した。また，糖鎖末端シアル酸の状態はWGA, SNA, RCAなどのレクチンを組み合わせて評価が可能であった。さらにGEM刺激によるGCXの変化は，シアル酸付加酵素であるST6Gal-Iの発現により制御されていることも明らかになった。
ST6Gal-Iによる糖鎖末端のシアル酸付加は細胞内ではゴルジ体で行われている。ゴルジ体は蛋白を合成する粗面小胞体に連続する細胞小器官で，蛋白質のペプチド鎖のフォールディングや糖鎖修飾を行っている。したがって，内皮傷害時にゴルジ体がどのように変化しているかを電子顕微鏡により超微形態的に観察することは，内皮GCXの傷害機序や内皮機能との関連性を知るために重要な手がかりを与えてくれると推察できる。
今後の研究の推進方策として，GEM刺激下の内皮細胞を走査電顕ならびに透過電顕で観察し，①細胞の表面GCXの形態やゴルジ体の変化の解析，②免疫電顕によるST6Gal-I酵素の細胞内局在の解析，さらに③内皮傷害の形態学的指標としての細胞間接着装置などの変化について観察し，内皮GCXの状態と内皮細胞の超微形態像の変化との関係を明らかにし，本研究の目的である「傷害から内皮を保護する治療」を考案する手がかりを得たいと考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度は研究者の事情により，研究を遂行することが出来ず，研究費も運用されていない。そのため，未使用額が発生している。
次年度の研究費は，培養内皮細胞を用いたin vitroの実験で内皮グリコキャリックス（GCX）の検出や糖鎖成分解析のための細胞培養試薬，蛍光色素標識レクチンや抗体などの試薬，免疫電顕を含む電子顕微鏡解析のための試薬や物品の購入に使用する。さらに，研究成果の発表や情報交換のための旅費，論文の英文校正料などに使用する予定である。
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