2020 年度実施状況報告書

メサンギウム細胞でのオートファジーを介した慢性腎臓病の病態解明と評価治療法の樹立

研究課題

研究課題/領域番号	19K08705
研究機関	徳島大学
研究代表者	長井幸二郎徳島大学, 病院, 講師 (40542048)
研究分担者	池田康将徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 教授 (60432754) 冨永辰也徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 准教授 (80425446)
研究期間 (年度)	2019-04-01 – 2022-03-31
キーワード	オートファジー / メサンギウム細胞 / 糖尿病性腎臓病 / ループス腎炎
研究実績の概要	慢性腎臓病は末期腎不全の原疾患であるだけでなく、心血管疾患発症のリスクが高く、生命予後を脅かすため、対応が急務である。その主たる原因として糖尿病性腎臓病や自己免疫疾患由来の腎症があげられるがその対応は進行を遅らせるにとどまり、不十分である。本研究はそういった腎疾患発症進展において腎糸球体におけるオートファジーの役割を解明することを目的としている。そのために令和2年度はLC3-GFPマウスを使用し、膠原病における代表的な疾患である全身性エリテマトーデスによるループス腎炎マウスモデル、MRL/lprマウスとLC3-GFPマウスを掛け合わせ、糸球体内のLC3-punctaの発現をオートファジー関連マーカーLC3染色にて確認した。現在腎糸球体構成細胞のマーカーとの二重染色にてその発現部位を確定している。もう一つのオートファジー関連マーカーである。P62の染色も施行し、現在解析中である。また、リソソーム阻害剤であるクロロキン投与にてオートファジーの亢進であるかどうか確認する実験系を施行中である。一方もう一つのループス腎炎モデルであるプリスタン誘導による腎障害をLC3-GFPモデルに引き起こし、解析したが、誘導に対するの多様性により、病変にばらつきがあり、これまでに確立した結果が得られていない。またLC3-GFPマウスをバッククロスしたあと、糖尿病モデルを誘導し、現在マウスの腎病変とLC3-punctaの存在を解析中である。In vitroではLC3-GFPマウスから腎糸球体をビーズ環流法で採取し、そこからメサンギウム細胞を採取している。ヒト腎生検組織を使用し、LC3,P62染色をおこない、全身性エリテマトーデス患者サンプルにてその発現を確認した。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由全身性エリテマトーデスによるループス腎炎マウスモデル、MRL/lprマウスとLC3-GFPマウスのかけあわせによる腎病変の解析は予定通り進行している。一方先に解析したプリスタン誘導による腎障害をLC3-GFPモデルに引き起こしたモデルにて確立した結果がでておらず、そのため全身性エリテマトーデス関連腎障害におけるオートファジーの関連の証明がおくれている。LC3-GFPマウスに対して糖尿病モデルを誘導したモデルについてはほぼ予定どおりであるが、全身性エリテマトーデスモデルの解析に時間がかかったため、ややその解析がおくれている。In vitroにおいてはほぼ予定通り採取がおこなわれているが、細胞のpassageを一定数確保する必要があるため、やや時間がかかっている。ヒト組織の解析については順調に進んでいる。
今後の研究の推進方策	全身性エリテマトーデスによるループス腎炎マウスモデル、MRL/lprマウスとLC3-GFPマウスのかけあわせによる腎病変の解析は予定通り進行しているため、現在ATG5 floxedマウスを胚操作でaliveとする手続き中である。今後LC3-punctaの発現部位にそって、上皮細胞特異的なPodocin-Creマウス、内皮細胞特異的なTie2-Creマウス、メサンギウム細胞特異的なタモキシフェン誘導型Foxd1-Creマウスのいずれかを使用し、細胞特異的オートファジー不全MRL/lprの確立を目指す。LC3-GFPマウスに対して糖尿病モデルを誘導したモデルに関して、その解析が終了すれば、やはり上記と同様なプロセスで細胞特異的オートファジー不全マウスに対し、糖尿病性腎臓病の誘導を行い、糸球体内におけるオートファジーの役割を解明する。In vitroにおいてはLC3-GFPマウス由来のメサンギウム細胞にPDGF,TNF-a,TGF-b1,BMP4といったループス腎炎や糖尿病性腎臓病に関わる代表的なサイトカイン刺激をおこない、LC3-punctaの発現、LC3-I,IIの発現を評価する。ヒトに関しては有意な所見をえた患者の背景とのcross-sectionalな評価を行い、加えて、リン酸化Smad1の染色を施行する。またその患者を中心に尿中smad1排出の評価を経時的に行い、おもにループス腎炎における病勢を反映するマーカーとして活用できるかどうか、予後解析と加えて確認する。
次年度使用額が生じた理由	プリスタン誘導によるループス腎炎モデルで予想された結果がえられなかったこと、糖尿病性腎臓病マウスモデルの解析がやや遅れたことからATG5 floxedマウスをaliveにすることが遅れたため、差額が生じた。今年度にマウス飼育費とその解析に使用する予定としている。