| 研究課題/領域番号 |
19K08720
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| 研究機関 | 新潟大学 |
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研究代表者 |
内許 玉楓 新潟大学, 医歯学系, 助教 (00529472)
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| 研究分担者 |
河内 裕 新潟大学, 医歯学系, 教授 (60242400)
福住 好恭 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (20609242)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ポドサイト / Ca2+活性化型陽イオンチャネル / TRPM4 / TRPC6 |
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| 研究実績の概要 |
初年度（令和元年度）のポドサイトにおけるTRPM4 のsplice variantの検討で、ポドサイトにおけるTRPM4b（全長）とTRPM4a（exon 3/4欠損）、exon 4単独欠損した分子型の存在を見出した。ネフローゼ症候群モデルでは、TRPM4b 、TRPM4aの発現の増加を観察したが、exon 4単独欠損分子の発現に変化はなかった。一方ですべての分子型に共通する部分を認識するプライマーでの検討では、発現の低下が見られた。これらの観察結果は、ポドサイトには病態形成に関わる別の分子型が存在することを示唆している。本年度（令和2年度）はTRPM4の新たな分子型の探索を行い、exon 12単独欠損、exon 15/16ダブル欠損の２つの分子型の存在を確認した。exon 12はTRPM4の立体構造の維持に関与しているドメインを、exon 15とexon 16はシグナル伝達分子Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate（PIP2）と結合するドメインを有している。今回同定した分子型の機能解析はTRPM4のポドサイトにおける固有の機能の解明につながると考えられる。
ポドサイトにおけるTRPM4の機能を解明するため、ヒトの培養ポドサイトを用いたノックダウン（KD）系での検討を行った。突起形成率、突起長など細胞の形態に著変はなく、スリット膜機能分子であるネフリンの発現にも変化がなかったが、TRPC6の発現が低下していることを確認した。この結果は、TRPC6はTRPM4と相互作用があることを示唆していると考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ポドサイトにおけるTRPM4のsplice variants発現の検討を行った。初年度で確認できた分子型以外に、TRPM4のチャンネル機能の制御に密接に関連するN-末端の領域に新たな分子型の存在を発見し、TRPM4はポドサイトにおいて多様な分子型を発現していることを見だした。
ポドサイトでは多様なTRPM4の分子型(splice variants)が存在することを確認した。ノックアウトマウスの解析では個別の分子型発現抑制ができないため、個別の分子型ごとにノックダウンが調節でき、かつマウスではなくヒトの培養ポドサイトを用いたTRPM4のsiRNA実験を行った。その結果、TRPM4発現の抑制時、同じくTRPチャネルに属し、ポドサイトの機能維持において重要な役割を果たしているTRPC6の発現が低下したという新たな知見を得ることができた。
TRPM4の新たな分子型を同定したこと、ノックダウン系の検討でTRPC6はTRPM4関連分子であることを示す知見が得られたことから、本研究はおおむね順調に進展していると考えた。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和3年度は、令和2年度の検討で発見したTRPM4分子型の機能解析を行う。具体的には、ネフローゼ症候群モデルを用いてこれらの分子型の発現が変化しているかどうかを解析し、これらの分子型がポドサイトの病態形成に関与するかを検討する。また、ポドサイトにおけるTRPM4の細胞膜貫通領域とCalmodulin結合ドメインなどを有するC-末端領域のsplice variant解析を行う。
令和2年度で作製した全てのTRPM4の分子型の発現を抑制させた培養ポドサイトの解析を進める。具体的には、①ネフリン以外のポドサイト機能分子の発現、局在変化の有無をReal-time PCR、免疫蛍光染色法により検討する。②TRPM4関連分子（14-3-3など）の発現、局在変化の有無をReal-time PCR、免疫蛍光染色法により検討する。さらに、個別の分子型の機能を解析するため、多種のsiRNAによる個別の分子型ごとのノックダウン培養ポドサイトを用いて、細胞の形態変化、ポドサイト機能分子とTRPM4関連分子の発現変化の有無を令和2年度と同様の方法で検討する。
令和3年度以降の検討として、TRPM4とTRPC6の相互作用の検討を行う。ポドサイトにおけるTRPC6の発現をsiRNAにより抑制させて、そこでTRPM4の局在と発現が変化するかを検討する。また、TRPM4のチャネル機能がTRPM4特異的阻害薬である9-Phenanthnolの処理により阻害された時に、TRPC6の局在、発現がどのように変化するかなどについての検討を行い、ポドサイト機能維持におけるTRPM4の役割を解明する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
遺伝子改変マウス作製と維持に関わる経費がなかったため、次年度使用に回すことができた。この部分の研究費は、令和3年度の分子型検討、RNAi実験のための消耗品経費及び、ネフローゼ症候群モデル動物の作製と維持費用に使用する予定である。
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