| 研究課題/領域番号 |
19K08731
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| 研究機関 | 埼玉医科大学 |
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研究代表者 |
井上 勉 埼玉医科大学, 医学部, 准教授 (30406475)
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| 研究分担者 |
岡田 浩一 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (60233342)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | CCN2 / 腎線維化 / 慢性腎臓病 |
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| 研究実績の概要 |
【研究の目的】本研究は慢性腎臓病の新規治療薬の開発を最終目的とした基礎研究である。その課程として本研究計画では、我々のこれまでの研究成果から明らかとなった「活性化尿細管上皮細胞が産生するCCN2の線維化促進作用」の詳細を検討し、新規治療薬候補の検討と、治療介入点を明らかにすることを目標としている。昨年度の研究成果を引き継ぎ、本年度も当初の研究計画通りに研究を進めた。
【FAKリン酸化部位の同定】昨年までに、我々が開発したCCN2Ex5koマウスではFAKのリン酸化以降の経路は正常に機能している事が確認された。FAKから転写因子に至るまでの経路を同定するため、wildとCCN2Ex5koマウスから作成した初代培養細胞を用いてex vivoの検討を重ねた。Western blotを用いた検討で、両細胞の差違から、FAK/Akt/GSK3b/b-cateninのaxisが最も有力であることが明らかとなった。次に、HK-2細胞を利用して、CCN2/integrin/FAKの相互作用を検証した。はじめに、RT-PCRを用いて、同細胞に発現しているintegrinのsubunitsを検討・同定した。我々が同定したintegrinは、腎におけるCCN2の受容体候補であり、かつ、抗線維化治療の介入点として有力であるため、同integrin subunitに対する特異抗体を用いてCCN2/integrin/FAKシグナルの阻害実験を行った。結果、抗integrin抗体での有意な阻害作用を確認するに至っている（結果について論文投稿中）。我々が同定した一連の経路の何れかを抑制することで、慢性腎臓病の治療が可能となる可能性が極めて高くなったため、計画していたFAK阻害薬に加えて、今回同定された細胞内シグナル伝達経路に寄与する各因子について、治療薬となり得る阻害薬候補の検討を行う方針とした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
CCN2から転写因子に至るまでの経路について詳細な検討が終了し、全容が明らかになった。さらにCCN2/integrinの相互作用については、FAKのリン酸化をマーカーとして、①変異型CCN2での抑制、②デコイペプチド、および、③抗integrin抗体を用いた相互作用の阻害、という複数の実験系を用いて現象を検証し、線維化に関わるCCN2側のモジュールと、対応する受容体として機能するintegrinの両者を、ほぼ完全に同定するに至った。変異型CCN2発現マウスであるCCN2Ex5koマウスを用いた検討で、CCN2で誘導されるFAKのリン酸化阻害のみで7割近い線維化抑制効果が認められたことから、我々が同定したCCN2/integrin/FAK → b-catenin経路の抑制が、本研究で目指す腎線維化（慢性腎臓病）の進行抑制治療におけるkey cascadeとなる可能性が高い。本研究計画立案時は、転写因子に至る下流域が明確ではなく、また、CCN2自体が多機能性を有する因子であるため、線維化に関わるintegrin/FAKリン酸化阻害を中心に治療薬のスクリーニング／開発を計画していた。しかし、最終的に機能する事が判明したb-cateninは、CCN2/integrin系だけではなく、同様に線維化に関わるシグナル伝達経路と考えられているTGF-b/Smad系やWnt/LRP6系とも共通する転写因子であり、さらに、古くから活性化尿細管上皮細胞で機能亢進する転写因子としても知られている分子である。以上のことから、b-cateninを治療のターゲットとしうる可能性もうまれた。ここまでの検討は計画よりも早く進んでいる。一方、FAKリン酸化部位の同定、複数モデル間での比較、CCN2作用との特異性を検証する点については、当初の研究計画にあるものの、研究の進捗がやや遅れている部分である。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度以降も当初の計画書通りの研究を予定している。昨年の推進方策に掲げた「FAK以下のシグナル伝達経路の同定」については予定よりも1年以上早く完了した。他の計画については若干の遅れがあるため、下記計画の一部は昨年の計画と重複している。
・慢性腎臓病モデルをWild（CCN2Ex5+/+）マウスおよびCCN2Ex5ko（＝-/-）マウスで作成、更に培養細胞系も用いてFAKのリン酸化部位、腎組織内での分布を検討し、CCN2の作用部位を具体的にする。これまでの検討で尿細管上皮細胞が作用ターゲットであることはほぼ間違いなく、今後はリン酸化部位の同定を急ぐ。integrinはCCN2に限らず、細胞外基質を中心に多くのリガンドと相互作用することが知られているため、線維化に限らず創傷治癒や炎症の過程でも活性化する。つまり、発症様式が異なるが最終的には線維化に至る複数の慢性腎臓病マウスモデルに共通し、横断的に活性化される部位を同定することが肝要となる。
・既存のFAK阻害薬の効果を検証する。計画書通り、候補としてはDefactinib、PND-1186、TEA226が挙げられる。特異性、投与経路、および既報の内容から優先順位を決定する。
・b-cateninの転写因子としての機能を抑制する複数の薬剤（いずれも抗腫瘍薬として開発されている）が知られており、その中の幾つかはphase I、phase IIにある。同薬剤を慢性腎臓病治療薬として転用できる可能性もあり、培養細胞、慢性腎臓病モデル動物を用いた検討を計画する。予算の関係で本計画中では実施が困難な場合は、次次年度以降の実験計画とし、新たな研究費の獲得を目指した検討を計画する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
試薬をバルク購入したことにより予定額よりも安価となったため。さらに、年度後半に必要となった試薬・消耗品の購入予定額が残金を越えるため、他の予算での支出を余儀なくされたため。以上の経緯で一部が次年度繰越となっておりますが、研究活動の規模は計画書通りです。
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