| 研究課題/領域番号 |
19K08919
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
池田 由美 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 研究員 (70826156)
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| 研究分担者 |
吉本 桂子 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 研究員 (20383292)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | シェーグレン症候群 / Toll様受容体 / BAFF受容体 / 単球 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は指定難病であるシェーグレン症候群（SS）の主要な腺病態である涙腺、顎下腺の組織障害機序の解明を通した新規治療標的の探索を行うことを目的としている。SSの主腺病態は炎症性細胞が涙腺や唾液腺などに浸潤することが原因とされるが、その詳細な機序は明らかではない。研究チームはこれまでSS患者末梢血単球ではBAFF受容体（BR3）発現が亢進しており、このことが単球の活性化に重要な役割を担っていることを見出した。また、SSの発症にはウィルス感染の関与や病変部位でのTLR発現亢進が報告されており、単球における自然免疫システムの活性化が病態形成の一因となると推測した。そこで単球のBR3発現亢進に関与する自然免疫機構を明らかにすることが組織障害機序の解明や新規治療標的の発見につながると仮説した。本年度は次に挙げる成果を得た。１）ヒト単球系細胞株THP-1においてTLR４刺激を加えた場合BR3発現とIL-6産生が亢進する、２）THP-1にTLR4刺激を加えるとTRL4と会合するMyD88発現上昇が認められ、MyD88阻害剤によりIL-6産生とBR3発現が抑制された。またTHP-1細胞にLPS刺激を加えたのちにBAFFを添加した場合、IL-6産生亢進が認められ、この亢進はMyD88阻害剤により抑制される、３）SS患者単球では健常人と比較してTLR4 MyD88発現が高い、４）健常人および患者単球をLPS刺激した場合、両者ともサイトカイン産生およびBR3発現上昇が認められるが、上昇率は患者の方が高い、５）SS患者単球にMyD88阻害剤存在下でLPS刺激を加えると、サイトカイン産生およびBR3発現の抑制が認められる。以上より、SS患者単球ではTLR4を介したシグナル経路が活性化し、このことがBR3発現亢進につながる可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究計画では本年度はSS患者末梢血単球におけるTLRのBR3発現機構への関与を検証することを目標と定めている。以下に成果の詳細を記載する。１）ヒト単球系細胞株THP-1を用いたBR3発現亢進機構の解析について、THP-1細胞にTLR1から9のアゴニストを作用させ、細胞におけるBR3発現についてFACS法ならびに定量PCR法で検証した。その結果、TLR4およびTLR5アゴニスト（LPSおよびFlagellin）にBR3発現亢進作用が認められたが、細胞活性化の指標であるIL-6産生についてLPSには亢進作用が認められたがFlagellinには認められなかった。２）THP-1におけるTLR4シグナル経路について、TLRに会合する分子であるMyD88の阻害剤がLPSによるBR3発現およびIL-6産生亢進を濃度依存的に抑制した。また、LPS刺激を受けたTHP-1に対してBAFFによるIL-6産生亢進が認められ、この亢進はMyD88阻害剤で抑制された、３）SS患者末梢血単球におけるTLR4とMyD88発現について、定量PCR法を用いてこれらの分子の遺伝子発現を比較検討したところ、健常人と比較して患者単球ではTLR4およびMyD88発現が亢進していた４）SS患者および健常人末梢血単球にLPS刺激を加えた場合、細胞上のBR3発現や細胞からのIL-6、IL-1β、IL-10などのサイトカイン産生が亢進される知見が得られた。その上昇率は健常人と比較して患者単球の方が有意に高い結果が示された。５）MyD88阻害剤存在下でSS患者末梢血単球にLPS刺激を加えると、BR3発現およびサイトカイン産生が抑制された。以上の結果よりSS患者単球におけるBR3発現亢進はTLR4およびMyD88を介したシグナル経路が関与していることが示唆された。上記より本研究は計画通りに順調に進捗していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
第1年次においてSS患者末梢血単球におけるBAFF受容体（BR3）発現亢進機構にTLR4とその下流に会合するMyD88分子が関与する知見を得た。これを踏まえ次年度はSS患者および健常人単球でのTLR4刺激下で活性化するタンパク質について、TRL4刺激を加えた単球を用いて、リン酸化が亢進されたタンパク質について網羅的解析を実施する予定である。この解析により得られる患者単球において有意にリン酸化が亢進しているタンパク質について、患者および健常人末梢血単球での発現を比較検討する。さらに候補となるタンパク質について治療標的としての有用性を検証する。具体的には候補タンパク質についてsiRNAを合成し、LPS刺激下でのBR3発現解析とサイトカイン産生など細胞の機能に対する作用を解析する。また既承認薬ライブラリーを用いて、LPS刺激THP-1における標的タンパク質の阻害剤スクリーニングを実施し、候補となる薬剤のBR3発現抑制効果を検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
第1年次の研究が順調に進捗し、仮説の正当性が検証された。そこで次年度において細胞を用いた網羅的解析の目途がたったと考え、その解析費用の一部としての使用を計画した。
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