| 研究課題/領域番号 |
19K08924
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| 研究機関 | 久留米大学 |
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研究代表者 |
山崎 聡士 久留米大学, その他部局等, 准教授 (30367388)
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| 研究分担者 |
井田 弘明 久留米大学, 医学部, 教授 (60363496)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 自己炎症性疾患 / 転写後制御 / 3'非翻訳領域 / mRNA半減期 |
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| 研究実績の概要 |
自己炎症症候群はmonogenicな発症機序によって起こる炎症性疾患である。しかし実臨床では、アミノ酸置換が起こらない遺伝子変異の症例も存在し、その病態は解明されていない。近年、自己炎症症候群におけるmRNAの3’非翻訳領域の変異が報告されているが、その病態メカニズムや病態形成への寄与度は解明されていない。
3’非翻訳領域はmRNAの分解や翻訳効率の制御配列であるため、遺伝子発現に大きな影響を与える。本研究計画ではmRNA代謝の解析技術を用いて、原因遺伝子の3’非翻訳領域の変異がこれを有するmRNAの発現制御に影響を与え、その結果原因遺伝子の機能の獲得や喪失につながるという、自己炎症症候群の病態モデルの検証を目的としている。
2019年度は、自己炎症症候群の既知の3’UTRの変異がレポーターmRNA代謝に及ぼす影響の検討をするために、Rabbit由来のglobin mRNAをレポーターとして用いることができるプラスミド、「pTet-7B」のglobin遺伝子の3’UTRに自己炎症性疾患遺伝子解析サイト「Infever」で3’UTRの変異が報告されている8遺伝子のうち、6遺伝子、IL1RN(2), MEFV(6), MVK(3), NLRP3(2), NRLP7(6), NOD2(6) (括弧内の数は、各遺伝子mRNA 3’UTRにおける変異の報告数)のクローニングおよびその配列確認のためのシーケンス、さらにこれらのレポーターの培養細胞での発現確認を完了した。
現在これらのプラスミドに報告されている3’UTR変異の導入を行っており、本年度中に作成したレポーターを用いたアッセイを行い、自己炎症症候群におけるmRNAの3’非翻訳領域の変異がもたらすmRNA代謝に及ぼす影響を評価する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2019年度の目標として、自己炎症性疾患遺伝子解析サイト「Infever」で開示された自己炎症性疾患で報告された変異を有する遺伝子のうち、3’UTRの変異が報告されている6遺伝子に関して、レポータープラスミドであるpTet-7Bへのクローニングおよび遺伝子配列確認が完了した。さらにこれらのプラスミドをU2OS細胞へトランスフェクション後、抽出したトータルRNAをサンプルとして、レポーターであるRabbit由来のglobin mRNAに対するプローブを用いてノーザンブロットを行い、レポーターの発現を確認した。
QuickChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit（アジレント・テクノロジー）を用いて、各遺伝子の3’UTRに変異を有したレポーターを作成中であり、順次配列確認と培養細胞での発現確認を進めており、本研究は概ね順調に計画は進捗している。
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| 今後の研究の推進方策 |
3’UTRの変異が報告されている6遺伝子をクローニングしたレポータープラスミドを細胞株へ遺伝子導入し、24時間後に Doxycyclinを添加したのち、0, 3, 6, 12 時間後にRNA抽出を行い、ノーザンブロットを行う。 ローディングコントロールとして遺伝子導入細胞株の内在 Nucleolin mRNAを用いる。各々 のバンドのDensityを画像処理ソフトImage Jによって定量し、レポーターであるglobin mRNA の半減期を算出する。3’UTR の変異によってglobin mRNAの半減期が延長すれば原因遺伝子 の “量的GOF”、短縮すれば原因遺伝子の“量的LOF”をもたらしたと結論づけられる。
Streptavidin (SA) に親和性を有する S1m配列を用いた技術により、標的3’UTRと4xS1m の融合RNA (釣り針RNA = bait RNA) を合成する。これを細胞株に導入して、標的3’UTRとこ れに親和性のあるRNA結合タンパク質の同定を試みる。このサンプルを用いて、既知のRNA-BP (TIA1, TTP, HuR, BRFなど) に関してはウェスタンブロットによる存在確認を行い、未知のRNA-BPの存 在に関してはアミノ酸解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
令和元年度末までに消耗品に使用予定であった33,648円を令和2年度に使用する。
次年度使用額が生じた理由は、令和元年2月から3月にかけて医局長として新型コロナウイルス予防や対応に従事していたため、一時的な研究実施の中断と、執行の時期を逸したためである。使用計画としては、今後本研究は予定通り研究計画を進めていくため、令和2年度の前半に使用する予定である。
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