| 研究課題/領域番号 |
19K08928
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| 研究機関 | 滋賀医科大学 |
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研究代表者 |
後藤 敏 滋賀医科大学, 医学部, 教授 (00211920)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | パラインフルエンザウイルス1型 / パラインフルエンザウイルス3型 / Cタンパク質 / インターフェロン / JAK1 / TYK2 / IFNAR2 / レスピロウイルス |
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| 研究実績の概要 |
本年度は、ヒトパラインフルエンザウイルス1型（hPIV1）およびヒトパラインフルエンザウイルス3型（hPIV3）、ウシパラインフルエンザウイルス3型（bPIV3）のCタンパク質によるⅠ型インターフェロン(IFN)応答経路の阻害機構について検討した。マウスパラインフルエンザウイルス1型（mPIV1）CがSTAT1およびJAK1、IFNAR2に結合するのに対して、hPIV1CはJAK1とIFNAR2、hPIV3CはIFNAR2、bPIV3CはSTAT1とIFNAR2に結合した。IFNAR2だけが、いずれのCとも結合する共通の分子であることがわかった。レセプター結合キナーゼJAK1、TYK２のチロシンリン酸化とそれに続く転写因子STAT1、STAT2のチロシンリン酸化は、いずれのCでも抑制された。次に、以前作成したmPIV1Cのアラニン置換変異体に相当する変異体をhPIV1CとhPIV3Cでもそれぞれ作成し、I型IFN応答経路阻害能を検討した。hPIV1C変異体でもCm5は阻害能を喪失していたが、mPIV1とは異なり、Cm6、Cm7、Cm8，Cm9、CF170Sでは5割程度の阻害能を示した。一方、hPIV3Cの変異体では、Cm5、Cm8，CF164Sに加えてCm7でも阻害能を喪失していた。hPIV3Cは、mPIV1Cと同じく、IFNAR2の細胞質側265番目から346番目のアミノ酸の領域に結合しており、どのhPIV3C変異体もIFNAR2への結合活性を残していた。hPIV3C変異体によるJAK1、TYK2、STAT1、STAT2のチロシンリン酸化の抑制は、各変異体の阻害活性によく相関した。以上の結果から、mPIV1だけでなく他のレスピロウイルスでも、Cタンパク質がIFNAR2を標的としてレセプター直下でシグナル伝達を阻害している可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
hPIV1CならびにhPIV3C、bPIV3Cの解析から、Cの標的はJAK1やSTAT1である可能性は低く、IFNAR２の可能性が高いと考えられた。また、いずれのレスピロウイルスでも、I型IFN応答経路の阻害には、レセプター結合キナーゼJAK1、TYK2の活性化抑制が重要であることから、レセプター直下でCは作用していると考えられた。レスピロウイルスCタンパク質の3つの標的分子候補（JAK1、STAT1、IFNAR2）の中から、ひとつの標的分子に絞れたことと、阻害ステップが明らかになったことから、当初の目標は概ね達成できた。しかしながら、hPIV3において作成したC変異体の中にも、IFNAR2との結合能を喪失した変異体が見つからず、IFNAR2が真の標的であることを積極的に示す証拠を得ることはできなかった。また、レセプター直下でCが作用するといっても、レセプター結合キナーゼであるJAK1やTYK2のチロシンリン酸化を実際どのように抑えているのかもはっきりしない。IFNAR2以外の未知の分子が標的である可能性も含め、さらに詳細に解析していきたい。
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| 今後の研究の推進方策 |
hPIV1CとhPIV3Cのアラニン置換変異体を作成したにも関わらず、標的分子がIFNAR2であることの確証を得ることができなかった。2021年度は、この問題の解決に向けさらに研究を進める。最初に、mPIV1CおよびhPIV1C、hPIV3Cの欠損変異体を作成し、CのIFNAR2との結合領域を明らかにする。その結果をもとに、結合領域のアミノ酸を置換したC変異体を複数作成し、その中から結合能を失った変異体を見つけ出す。これらの変異体のI型IFN応答経路に対する阻害能を調べ、IFNAR2が真の標的であるかどうかを検討する。さらに、標的分子との結合能を喪失したC変異体を発現する組換えmPIV1を複数デザインし、reverse genetics法により組換えウイルスを作成する。Cのopen reading frame(ORF)は、PのORFと重なっているので、組換えウイルス作成時にはPのORFに影響を与えないようにP ORFとC ORFを独立させた組換えウイルスの作成等も考慮する。生ワクチン候補として、IFN非産生細胞（Vero細胞等）では増殖するが、IFN産生細胞（HeLa細胞やA549細胞）では増殖が抑制される組換えmPIV1を選別する。候補ワクチン株は、最終的にマウスでの増殖と抗体誘導能を調べ、ワクチンとして有効かどうかを検討する。
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