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2020 年度 実施状況報告書

オキサシリン感性MRSAの感性化メカニズム解明によるβラクタム薬耐性の統合的理解

研究課題

研究課題/領域番号 19K08960
研究機関自治医科大学

研究代表者

渡邊 真弥  自治医科大学, 医学部, 准教授 (60614956)

研究分担者 相羽 由詞  自治医科大学, 医学部, 助教 (60783694)
研究期間 (年度) 2019-04-01 – 2022-03-31
キーワードメチシリン耐性黄色ブドウ球菌 / MRSA / 薬剤耐性菌 / βラクタム薬 / オキサシリン感性黄色ブドウ球菌
研究実績の概要

メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)は院内感染の指標耐性菌のひとつであり、医療現場において監視が必要な耐性菌である。MRSAは、βラクタム薬耐性に寄与するPBP2a(PBP2’)をコードするmecAを保有する。しかし、mecA陽性にも関わらず、MRSAスクリーニングに用いるβラクタム薬であるオキサシリンに感性を示す「オキサシリン感性mecA陽性黄色ブドウ球菌(OS-MRSA)」が、臨床分離メチシリン感性黄色ブドウ球菌(MSSA)の中からしばしば検出される。OS-MRSAは、MSSAと誤判定されることでβラクタム薬治療が開始され、そのβラクタム薬暴露により耐性化する可能性があることが臨床上の問題である。本研究課題では、なぜOS-MRSAがmecA遺伝子を持っているにも関わらずβラクタム薬に感性を示すのか、またOS-MRSAがβラクタム薬暴露により耐性化するメカニズムを明らかにすることを目的としている。申請者らは、世界各地よりOS-MRSA株43株を収集し、そのゲノム解析を行った。ゲノム解析の結果、OS-MRSAの遺伝学的背景は多様であった。さらに、26株の代表的なOS-MRSA株から、オキサシリン暴露により、100株の耐性化株を作出し、その変異部位を同定した。その中で、最も多い変異遺伝子はRNA合成酵素遺伝子rpoBCであり、次に多いのはヌクレオチド合成酵素遺伝子(guaA、prs、hptT)であった。代表的な耐性変異株の全遺伝子発現解析より、耐性化株ではこれらの遺伝子を含むヌクレオチド合成系や飢餓応答に関わる遺伝子が発現減少していた。一方で、mecAやPBP2aの発現量は耐性化と関連性があるものの株によって差異がみられた。mecAやPBP2aの発現上昇に加え飢餓応答遺伝子等の発現変化により、OS-MRSAがOXAに対して耐性化すると結論づけられた。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

申請者らは、現在までに世界各地よりOS-MRSA株43株を収集している。さらに、対象となる臨床分離MRSA株3,000株以上を保有し、その一部を本研究課題に用いている。収集したOS-MRSA株のβラクタム薬を初めとする薬剤感受性を測定し、本研究課題で用いるOS-MRSA株全てが、オキサシリンに対して感性を示すことを確認している。OS-MRSA株のゲノム解析を行ったところ、全ての株でmecA陽性であり、11のMLST型と4のSCCmec型を持つことが明らかになった。つまり、OS-MRSAはひとつのクローンから派生したのではなく、多様な遺伝学的背景を持つことがわかった。さらに、26株の代表的なOS-MRSA株に対して、オキサシリンを暴露することにより、オキサシリン耐性化株を合計100株選択した。これらの耐性化株のゲノム解析を行ったところ、70株がゲノム上に1か所変異を有し、4株が1つの遺伝子に2か所変異をもち、残りの26株が遺伝子間領域を含む2か所以上の部位に変異をもつことが明らかとなった。さらに、100株の耐性化株の中で96株が1つ以上のnonsynonymous変異かframeshift変異をもつことから、これらの変異によりβラクタム薬耐性化していることが推測された。しかし、それらの変異はmecA自体やその制御遺伝子に存在せず、RNAポリメラーゼ遺伝子(rpoBC)やプリン合成系(guaA、prs、hprT)、タンパク品質保持系(clpXP、ftsH)などに変異を持っていた。一方で、mecAやPBP2aの発現量は耐性化と関連性があるものの株によって差異がみられた。mecAやPBP2aの発現上昇に加え飢餓応答遺伝子等の発現変化により、OS-MRSAがOXAに対して耐性化すると結論づけられた。

今後の研究の推進方策

一昨年度、臨床分離OS-MRSA株からβラクタム薬により選択した耐性化株をゲノム解析し、OS-MRSAの耐性化に関わる変異を同定した。昨年度は、これらの変異による耐性化メカニズムを明らかにするために、RNA-seqを用いた網羅的発現解析を行った。変異解析では、ヌクレオチド合成に関わる遺伝子に変異が蓄積しており、発現解析からはヌクレオチド合成系に関わる遺伝子発現の減少がみられたことから、ヌクレオチド合成に関わる遺伝子が耐性に寄与していると考えられる。そのため、本年度は、OS-MRSAやその耐性株のヌクレオチド合成に関わる代謝産物(ATP、GTP、ppGpp等)を定量する。

次年度使用額が生じた理由

本年度参加予定であった学会がオンデマンドで行われ、学会参加費、旅費が不要であった。来年度は、本研究課題をさらに推進するために、次年度使用額を試薬購入費として使用する予定である。

  • 研究成果

    (7件)

すべて 2021 2020

すべて 雑誌論文 (4件) (うち国際共著 1件、 査読あり 4件、 オープンアクセス 4件) 学会発表 (3件)

  • [雑誌論文] Identification and characterization of mutations responsible for the β-lactam resistance in oxacillin-susceptible mecA-positive Staphylococcus aureus2020

    • 著者名/発表者名
      Boonsiri Tanit、Watanabe Shinya、Tan Xin-Ee、Thitiananpakorn Kanate、Narimatsu Ryu、Sasaki Kosuke、Takenouchi Remi、Sato’o Yusuke、Aiba Yoshifumi、Kiga Kotaro、Sasahara Teppei、Taki Yusuke、Li Feng-Yu、Zhang Yuancheng、Azam Aa Haeruman、Kawaguchi Tomofumi、Cui Longzhu
    • 雑誌名

      Scientific Reports

      巻: 10 ページ: 16907

    • DOI

      10.1038/s41598-020-73796-5

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Development of CRISPR-Cas13a-based antimicrobials capable of sequence-specific killing of target bacteria2020

    • 著者名/発表者名
      Kiga Kotaro、Tan Xin-Ee、Ibarra-Ch?vez Rodrigo、Watanabe Shinya、Aiba Yoshifumi、Sato’o Yusuke、Li Feng-Yu、Sasahara Teppei、Cui Bintao、Kawauchi Moriyuki、Boonsiri Tanit、Thitiananpakorn Kanate、Taki Yusuke、Azam Aa Haeruman、Suzuki Masato、Penad?s Jos? R.、Cui Longzhu
    • 雑誌名

      Nature Communications

      巻: 11 ページ: 2934

    • DOI

      10.1038/s41467-020-16731-6

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Association of mprF mutations with cross-resistance to daptomycin and vancomycin in methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA)2020

    • 著者名/発表者名
      Thitiananpakorn Kanate、Aiba Yoshifumi、Tan Xin-Ee、Watanabe Shinya、Kiga Kotaro、Sato’o Yusuke、Boonsiri Tanit、Li Feng-Yu、Sasahara Teppei、Taki Yusuke、Azam Aa Haeruman、Zhang Yuancheng、Cui Longzhu
    • 雑誌名

      Scientific Reports

      巻: 10 ページ: 16107

    • DOI

      10.1038/s41598-020-73108-x

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Complete Genome Sequence of a Panton-Valentine Leukocidin-Negative Staphylococcus aureus Strain Isolated from a Patient with Pervasive Necrotizing Soft Tissue Infection2020

    • 著者名/発表者名
      Aiba Yoshifumi、Watanabe Shinya、Tsukahara Rieko、Umemoto Naoka、Thitiananpakorn Kanate、Boonsiri Tanit、Li Feng-Yu、Kiga Kotaro、Sato’o Yusuke、Tan Xin-Ee、Taki Yusuke、Azam Aa Haeruman、Zhang Yuancheng、Sasahara Teppei、Demitsu Toshio、Cui Longzhu
    • 雑誌名

      Microbiology Resource Announcements

      巻: 9 ページ: e00295-20

    • DOI

      10.1128/MRA.00295-20

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] 毒素性ショック症候群を発症した黄色ブドウ球菌の毒素産生制御機構の解明.2021

    • 著者名/発表者名
      ○瀧 雄介,渡邊 真弥,佐藤 祐介,李 峰宇,Kanate Thitiananpakorn,XinEe Tan,相羽 由詞,氣駕 恒太朗,笹原 鉄平,崔 龍洙.
    • 学会等名
      日本細菌学会総会
  • [学会発表] CRISPR-Cas13 を用いた細菌遺伝子検査用抗菌カプシドの作製条件の最適化.2021

    • 著者名/発表者名
      ○西川 裕太郎,氣駕 恒太朗,渡邊 真弥,XinEe Tan,鈴木 貴子,下條 誉幸,崔 龍洙
    • 学会等名
      日本細菌学会総会
  • [学会発表] Generation of phagemid-based CRISPR-Cas13 antimicrobials against MRSA.2021

    • 著者名/発表者名
      ○李 峰宇,氣駕 恒太朗,Xin-Ee Tan,渡邊 真弥,佐藤 祐介,相羽 由詞,Kanate Thitiananpakorn,瀧 雄介,笹原 鉄平,崔 龍洙
    • 学会等名
      日本細菌学会総会

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公開日: 2021-12-27  

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