|
膵β細胞の発生や成熟、インスリン分泌能、糖尿病の発症や進行に深く関わる転写因子Mafaを欠損させた未成熟であるが増殖能を持つMafa欠損β細胞株（MIN6-Mafa-KO）とMafa-rescue β細胞株をもちいて解析を進めてきた。その過程で、Mafaを発現させ続けても十分に成熟しないことが分かってきた。そこで、Mafa発現はグルコース応答性を得るという１段階目の成熟に必要であるが、更なる成熟過程が存在するのではないかと考えた。本研究課題は、２段階目の成熟過程に必要な環境や因子を広く探求することを目的としている。
今年度は、新たに樹立し機能的に成熟していることを確認したMIN6細胞株（MIN6-CB4）のMafa遺伝子をCRISPR/Cas9システムによりノックアウトしたクローンについて、さらに解析を進めた。Mafaノックアウトクローン22個についてウェスタンブロットや免疫染色、遺伝子発現などの解析を詳細に行い、両アレルともノックアウトされているホモノックアウトクローンを4クローン得た。各クローンについてグルコース応答性インスリン分泌（GSIS）やインスリン含量、増殖力、遺伝子発現パターンなどを解析した。その中の3クローンについてrescue 細胞を作製し、機能の解析を行った。総合的な解析から最終的に1クローンを選び、Mafaノックアウトとそのrescue細胞について、RNA-seqを行った。そして、遺伝子発現についてMIN6-CB4細胞やMIN6-Mafa-KO細胞、Mafa-rescue細胞と比較検討を行った。その結果、MIN6-CB4細胞、MIN6-Mafa-KO細胞、Mafa-rescue細胞の群のみで比較して得られた候補遺伝子・因子以外にもβ細胞の成熟に関与すると思われる遺伝子・因子が見い出された。
|
