研究課題
インクレチン（GLP-1, GIP）はcAMPシグナルを介してグルコース濃度依存的にインスリン分泌を促進する。代表者らはこれまでに膵β細胞内のグルコース代謝とcAMP作用の相互作用において、グルコース代謝で産生されたグルタミン酸が必須であることを明らかにしたが、グルタミン酸が顆粒の開口分泌を制御する機序は不明である。本研究では、インスリン顆粒の比較プロテオミクスにより得られた候補分子の機能解析により、グルタミン酸による開口分泌制御機構を明らかにする。本年度は以下の研究を行った。1）インクレチン/cAMP/グルタミン酸シグナルで変動する顆粒タンパク質のインスリン分泌における機能の解明：インスリン顆粒の比較プロテオミクスで得られた候補分子についてsiRNAによるノックダウン実験を行ったところ、特にVAMP7のノックダウンによりインクレチンによるインスリン分泌が減弱した。また、経時的にインクレチン応答性障害を呈する糖尿病モデルであるZFDMラットの膵島を用いてRNA-seq解析を行ったところ、インクレチン応答性の障害にともない複数の候補分子の発現低下が認められた。2）インスリン顆粒へのグルタミン酸取り込みによるV-ATPaseおよびVAMP2の制御機構の解明：1）の結果よりVAMP7がインクレチンによるインスリン分泌に関与することが示唆されたが、一方でVAMP2やVAMP8などのアイソフォームはインスリン分泌に関与することが知られている。また、VAMP2はV-ATPaseとの相互作用により開口分泌を制御することが報告されている。これらの分子群のインクレチン/cAMP/グルタミン酸シグナルによるインスリン分泌における役割を明らかにする目的で、V-ATPaseの構成サブユニットとVAMPの会合変化を蛍光顕微鏡により可視化するために、それぞれの蛍光タンパク融合プローブを作製完了した。
2: おおむね順調に進展している
ほぼ計画通りに進行しているため。
1）インクレチン/cAMP/グルタミン酸シグナルで変動する顆粒タンパク質のインスリン分泌における機能の解明：前年度に引き続き、VAMPs（VAMP2やVAMP7)、V-ATPaseおよびその他の候補分子について、膵β細胞株においてノックダウンやゲノム編集を行い、インスリン開口分泌における役割を生化学・分子生物学的手法により検討する。また、病態生理学的な役割を明らかにするために、糖尿病モデル動物の膵島において候補分子の発現量や機能の変化を検討する。2）インスリン顆粒へのグルタミン酸取り込みによるV-ATPaseおよびVAMP2の制御機構の解明：前年度に作製した各種蛍光プローブを膵β細胞に発現させ、グルタミン酸刺激下でのV-ATPaseとVAMPsの会合変化を共焦点蛍光顕微鏡により観察するとともに、全反射蛍光顕微鏡により開口分泌ダイナミクスを解析することにより、インクレチン/cAMP/グルタミン酸によるインスリン顆粒の開口分泌における候補分子の役割を明らかにする。
すべて 2020 2019
すべて 雑誌論文 (3件) (うち国際共著 2件、 査読あり 3件、 オープンアクセス 3件) 学会発表 (8件) (うち国際学会 3件、 招待講演 2件)
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