| 研究課題/領域番号 |
19K09097
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
桐野 浩輔 九州大学, 大学病院, 助教 (00621707)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | ヒト多能性幹細胞 / ES細胞 / iPS細胞 / CRSPR/Cas9 / 神経芽腫 / 交感神経細胞 |
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| 研究実績の概要 |
はじめに、ヒト多能性幹細胞から交感神経細胞およびその前駆細胞への分化誘導法を再現した。この誘導方法は自らが他研究機関(京都大学iPS細胞研究所)において開発したものである。現在の研究室においても、同じ方法によってヒト多能性幹細胞の維持および分化誘導が再現可能であることを確認した。
次に血清型1のアデノ随伴ウイルス(AAV1)ベクターを用いて、CRSPR/Cas9のsgRNAを2つ同時に発現するdual-sgRNAベクターを構築した。すでに構築済みのレンチウイルスベクターをもとに遺伝子組み換えを行い、速やかにベクターを構築した。さらに、複数のsgRNAをランダムに組み合わせてdual-sgRNAベクターライブラリーが構築できることも確認した。
このベクターを用いて、1p36領域28Mbpの欠失を試みた。以前にレンチウイルスベクターを使用した際と同様に、HeLa細胞において欠失が確認されたが、ヒト多能性幹細胞およびヒト多能性幹細胞より分化誘導された交感神経細胞や前駆細胞においては欠失を導入することが出来なかった。交換神経細胞へのウイルス感染実験については、AAV1はレンチウイルスに比し遥かに感染効率が良いが、それでもなお28Mbpもの大きな欠失を引き起こすのは難しいことが予想された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ヒト多能性幹細胞やベクターの取り扱いについて、新しい研究環境における実験再現と最適化に時間を要した。
COVID-19感染拡大に伴う緊急事態宣言により、研究実施や共通実験機器使用に大きな制限がかかっており、今後も進捗に遅れが生じることが予想される。
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| 今後の研究の推進方策 |
「MYCN遺伝子の強制発現によりアポトーシスする交感神経前駆細胞が、何らかの2nd hitにより生き残る」という作業仮設を支持するために、まずは頻度の低いCRSPR/Cas9による大きな欠失ではなく、同様の効果が期待され導入が確実であるALK遺伝子の強制発現を試す。MYCNとALKによる形質転換モデルが構築されれば、あらためて1p36領域の欠失に挑戦する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度はヒト多能性幹細胞やベクターの取り扱いについて、新しい研究環境における実験再現と最適化に時間を要した。次年度は引き続きMYCN強制発現 + 1p36欠失による交感神経細胞の形質転換が可能であるか検証する。
使用計画：試薬、抗体、実験器具に使用
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