| 研究課題/領域番号 |
19K09107
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| 研究機関 | 東邦大学 |
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研究代表者 |
辻 昭一郎 東邦大学, 医学部, 非常勤研究生 (70726736)
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| 研究分担者 |
桑原 卓 東邦大学, 医学部, 准教授 (40385563)
田中 ゆり子 東邦大学, 医学部, 講師 (40396685)
近藤 元就 東邦大学, 医学部, 教授 (20594344)
森田 勇人 城西大学, 理学部, 教授 (50274303)
羽賀 博典 京都大学, 医学研究科, 教授 (10252462)
上本 伸二 京都大学, 医学研究科, 教授 (40252449) [辞退]
加藤 悠太郎 藤田医科大学, 医学部, 教授 (70265833)
犬飼 美智子 藤田医科大学, 医学部, 助手 (00839186)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 免疫寛容 / 移植 / マウス / アデノ関連ウイルス / 制御性T細胞 / リンパ球キメラ / PD-1 / IDO産生細胞 |
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| 研究実績の概要 |
2021年度に作成した2種類のプラスミド（H2-KdまたはGFPのコーディングシークエンスを改変pAAVベクターに挿入したプラスミド（2020年度成果報告書参照））それぞれについてpRCベクター、pHelperベクター（いずれもAAVpro Helper Free System (AAV2): タカラバイオ）とともに無血清DMEM培地中で混合したものにTransIT-293 Trasnsfection Reagent を添加し、あらかじめ播種しておいたHEK293T細胞へのトランスフェクションを行った後さらに数日培養を行うことで、AAV産生細胞を作出した。
得られた細胞を回収後、 AAV Extraction Solution （タカラバイオ）を用いてAAVベクターの抽出を行った。抽出したAAVベクターはAmiconTM Ultra-4 50 KDa （ミリポア）を用いて濃縮後、AAVpro Titration Kit (for Real Time PCR) Ver.2を用いてウィルスのタイターを測定し、マウスへの遺伝子導入実験に使用可能なウィルスベクター濃度であることを確認した（>107 vg/micro L）。
得られた精製AAVベクターは1頭当たり200 micro L をC57/BL6マウス(雌6週齢)に尾静脈より投与し、その後継続して飼育することで肝臓へ目的遺伝子が導入されたC57/BL6マウス作製を試みた。
マウスの同所肝移植による肝障害の程度と拒絶の程度を計測や血中酵素のELISAおよび組織の免疫染織法を用いて検討した。また血中の発現タンパクの増減についても検討をおこなった。また虚血後の再灌流障害の程度についてもUW液の有無による違いを検討した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
研究者自身が新型コロナウイルスに感染した。また研究者が勤務している病院において新型コロナウイルスのクラスターが3回に渡り発生したため、相当期間、研究ができなかったため、研究の進行が大幅に遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
2022年度終了時点で、投与が完了したところであったため、2023年度は4か月経過ごろまで継続して飼育を行い、GFPのマウス肝臓での発現レベルをGFPの蛍光を指標して観測することで、H2-Kd の発現が十分に行われているかを確認する予定である。
また、H2-Kd の発現レベルを直接観測するシステムとして、H2-Kd の下流にルシフェラーゼを導入したAAVの作製ならびに遺伝子導入マウスの作製も並行して進める予定である（発現レベルの確認は城西大学に既設のIVIS システムを用いて行う予定）。なお、ルシフェラーゼの共発現系は、肝臓でルシフェラーゼに対する抗体も生産されると予測されるため経時的な導入遺伝子産物の蓄積レベルのモニタリングには使用可能であるが、免疫寛容の実験には、H2-Kdのみを発現するマウスを用いて行うことが必須であると考える。
さらにC56BL/6マウスにはMHCとしてH2-Kbが発現しているが、これをH2-Hdに置換したC56BL/6-Kdマウスをノックインの手法にて作成する予定である。
これらを用いて、免疫寛容におけるPD-1の役割について検討を行う。また制御性T細胞やIDO産生細胞を抗体などにより抑制することによりこれらの免疫寛容における働きについても検討する。
H2-Kd導入マウスにおいてはリンパ球キメラの状態となる。これらのキメラ発生のメカニズムをそれぞれのMHCの発現量あるいは関連タンパク量の増減にて検討する。またマウスの同所性肝移植によりマウスの肝臓よりH2-Kdを除去し、免疫寛容における肝臓の役割と免疫寛容維持のメカニズムを検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究者本人が新型コロナウイルスに感染するなど、2022年度は2021年度以上に研究に遅れが生じている。そのため未使用分が発生している。しかし次年度は新型コロナウイルスが5類に変更になったため、研究の進捗が期待される。当初の計画どおり、ノックインマウスの作成、遺伝子導入実験おより肝移植実験、臨床症例との比較を行っていく。
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