| 研究課題/領域番号 |
19K09131
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
宮戸 秀世 自治医科大学, 医学部, 講師 (90813163)
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| 研究分担者 |
北山 丈二 自治医科大学, 医学部, 教授 (20251308)
細谷 好則 自治医科大学, 医学部, 教授 (30275698)
大澤 英之 自治医科大学, 医学部, 講師 (60458271)
井上 賢之 自治医科大学, 医学部, 講師 (80375279)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 好中球細胞外トラップ / 腹膜播種 / 免疫 / エクソソーム |
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| 研究実績の概要 |
マクロファージは抗菌活性、抗腫瘍効果を持つM1型と血管新生や免疫抑制を介して腫瘍増殖を促進させるM2型のマクロファージに大別され、TAMの多くはM2型マクロファージで構成され、TAMの浸潤度が悪性度と相関する。近年、がん組織には好中球も多く存在し、一部が細胞外トラップ(NETs)を起こしていることが解ってきた。そこで、NETｓのマクロファージの分化と活性化リンパ球の遊走に対する影響をin vitroで検討した。
健常人から末梢血単核球(PBMC)を採取し、autoMACS Separatorを使用したポジティブセレクション法によりCD14(+)単球(PBMo)を分離した。また好中球をPMAで刺激し、NETsを作成させCD14(+)単球と3日間混合培養し、M1/M2マーカーをFlow cytometryで定量したところ、CD80が有意に上昇し、CD163などのM2マーカーの発現は抑制された。また、上清中のTNF-alphaの産生が亢進し、NETsはM1への分化を促進する傾向が見られた。
また、ダブルチャンバーの上層にCD3抗体で2日間刺激したT細胞と上記のNETsと共に加え、下層にリンパ球遊走因子CXCL10, CXCL11を添加し、6時間後遊走能を評価したところ、NETsは有意に遊走を抑制したが、その効果はDNAse1の添加によって打ち消された。
さらに、クローニングリングを用いて内部にPMA刺激好中球由来のNETsを加え、外部にIL-2で活性化リンパ球を分離して存在させた後、リングを除去し、境界部をタイムラプス動画で撮影すると、NETs存在部へのリンパ球の侵入は見られなかったが、DNAse1を加えNETsを分解しておくと、容易に内部に移動する現象が確認された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
単球との共培養にてNETsがM2マクロファージへの分化を抑制する作用を持つことが解った。また、ダブルチャンバーを用いた遊走実験とタイムラプス動画を用いた実験で、NETsが活性化リンパ球の遊走を物理的に阻害する作用を持つことも確認できた。以上の事実から、がん組織内のNETsはがんに対する局所免疫に対して大きな影響を与えていることが強く推測される。さらに、エクソソームが効率的にNETsに捕捉されることも確認することが出来ている。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．単球の分化に対する影響に関して、これまでの知見に加えてM1マーカーのMHC-II, CD80, CD86, PD-L1, PD-L2の抗原発現、およびケモカインの産生状況についてFlowcytometry, ELISAを用いて追加検討する。
２．ヒト胃癌細胞腹膜高転移株MKN45Pの培養上清から超遠心法を用いてエクソソームを分離、その組成をNanosightにて確認した後、PKH26にて蛍光染色し、上記の方法で作成したNETs上に添加、一定時間後に洗浄し、エクソソームがNETs捕捉されるか？を蛍光顕微鏡で観察する。また、NETsの存在下で同一患者由来のTリンパ球、単球に添加し、癌細胞由来のエクソソームのTリンパ球、単球の細胞機能への影響の相違を明らかにする。
３．腹膜転移能の異なる2種類のマウス胃癌細胞のYTN16および高腹膜転移株YTN16P2細胞を、C57BL/6マウスに1x105-107個を腹腔内投与し、4週後に腹膜播種の形成状況を把握する。またカゼイン腹腔内投与滲出した好中球を分離、培養しNETsを作成し、YTN16細胞と共投与してヌードマウスの系と同様に腹膜播種が増強するかどうか？さらに、DNAseの腹腔内共投与でNETsを分解することで、播種の増強が抑制されるか？を検討し、免疫能を有するマウスにおけるNETsの腹膜播種促進効果の有無を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
単球との共培養実験とタイムラプス動画を用いた実験が支障なく施行することができ、予定していた実験回数よりも少ない回数で結論を導き出すことができたため、必要な試薬、機器にかかる経費を削減することができた。そこで、その分を次年度以降のエクソソームに関する実験に使用する事にした。
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