| 研究課題/領域番号 |
19K09181
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| 研究機関 | 地方独立行政法人神奈川県立病院機構神奈川県立がんセンター(臨床研究所) |
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研究代表者 |
廣島 幸彦 地方独立行政法人神奈川県立病院機構神奈川県立がんセンター(臨床研究所), 臨床研究所, 医長 (60718021)
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| 研究分担者 |
黒滝 大翼 横浜市立大学, 医学部, 講師 (10568455)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 膵癌 / 微小環境 / PDX / 遺伝子発現 / 腫瘍免疫 / SMAD4 |
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| 研究実績の概要 |
（I）Humanized PDXモデルの作成：(a) PDXの樹立：膵癌患者から摘出された癌組織の一部を摘出後可及的速やかに免疫不全マウス（NSG mice）の皮下に移植し、その後継代維持することにより13系統の膵癌PDXを樹立した。樹立したPDXのうち、7系統からTotal RNAを抽出し、messenger RNA用ライブラリーを作成し、シークエンスを実施した（Hiseq 4000, Illumina）。シークエンスで得られた混在したリードをXenome を用いて、宿主由来（TME）リードと移植片由来（癌細胞）のリードに分離し、各々のカウントデータを作成した。癌細胞のカウントデータを用いて、SMAD4（NM_005359）の発現量を確認すると7系統1系統で著名な発現低下（他の1/10程度の発現）を認め、SMAD4欠失型と考えられた。公共データベース（TCGA）の結果では、膵癌におけるSMAD4欠失の頻度は15％程度であったので、今回の結果は妥当な結果と考えられた。
(b) Human cell reconstituted NOG miceの作成：NOGマウスに全身照射後、ヒト臍帯血由来CD34陽性細胞を静注し、8 週間後にFACSにてヒト成熟免疫細胞が生着していることを確認後、上記にて樹立したPDXのうち3系統を皮下移植したが、PDXは生着しなかった。通常のNOGマウスでは生着するので、移植したヒト免疫細胞がPDXを非自己と認識し、拒絶したものと考えられた。
PSMB1以外にも膵癌微小環境を構築するマスター制御因子を同定するため、前述の膵癌間質のプロテオミクス解析から同定した膵癌間質で優位に発現変動している分子群と膵癌細胞との相互作用解析を施行し、FNとITGに関連する8つのInteractionの同定に成功した（2019年日本癌学会にて発表）。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
膵癌患者から摘出された癌組織からPDXを作製し、13系統の膵癌PDXの樹立に成功した。そのうち7系統についてRNAseqを実施し、遺伝子発現データを取得した。7系統中１系統でSMAD4の著名な発現低下を認め、SMAD4欠失型膵癌（膵癌の15％程度）のPDXも確保できた。Human cell reconstituted NOG miceの作製については、予定通り作製には成功したが、市販の造血幹細胞を移植したモデルではPDXは生着しないという示唆に富む発見をした。PDXを用いた腫瘍免疫解析のin vivoモデルについては、大幅に計画を変更する必要が生じたが、NOG、Nudeなどの免疫不全マウスでもマクロファージなどのミエロイド系細胞の解析は可能である。以上より、総合的に考え概ね予定通りに研究が進んでいると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度、Human cell reconstituted NOG miceついて、市販の造血幹細胞を移植したモデルではPDXは生着しないという示唆に富む発見をした。本モデルを完成させるには、移植免疫細胞とPDXのHLA型を一致させることが必要と考えられたが、現状での実現は難しいと考え、PDXの系では、マクロファージなどのミエロイド系免疫細胞の解析を主に行う方針とした。同時に、本研究でターゲットにする免疫細胞を腫瘍関連マクロファージ（TAM）とする。今後は、PSMB1の膵癌組織における発現状況をTMAを用いて検証すると同時にPDXを用いて阻害薬による治療効果を検討し、間質細胞（免疫細胞はミエロイド系細胞のみ）のFractionの変化をFACS、RNAseq dataを使ったDeconvolution解析で検討していく。
また、PSMB1以外の膵癌微小環境マスター制御因子の同定も平行して行っていく。具体的には、PDXの宿主由来リードから膵癌TMEの発現データを取得し、TAMやCAFの制御に関わる因子を探索する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
Human cell reconstituted NOG miceついて、市販の造血幹細胞を移植したモデルではPDXは生着しないという知見を得て、Human cell reconstituted NOG miceモデルの作製を中止し、代替案での研究遂行となったため。
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