| 研究課題/領域番号 |
19K09229
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| 研究機関 | 東邦大学 |
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研究代表者 |
有田 通恒 東邦大学, 医学部, 助教 (80307719)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | EMAST / DNAミスマッチ修復 / 低酸素 / p53 / 進行大腸癌 |
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| 研究実績の概要 |
進行大腸癌ではマイクロサテライト不安定性の一形式EMASTが悪性度とよく相関する。また、EMASTを低酸素性に誘導する培養条件ではp53が変異が必須である。本研究ではEMAST腫瘍の悪性な表現型とp53変異との関係性を明らかにすべく解析を進めている。3年目に当たる2021年度は、簡便で迅速なEMAST検出法を確立するため、1）蛍光タンパク質発現でEMAST発生を検出できるレポーター細胞株の作製を継続した。並行して、2）低酸素性EMAST誘導条件の向上と、3）EMAST誘導におけるp53の関わり方についての検討も行った。
1）レポーター細胞株については、現在、親株細胞ゲノムの内在性EMAST型マイクロサテライト配列（EMAST配列）をレポーター配列に置換したクローンを選別している。2）これまでに特定していた低酸素とp53変異に加え、細胞密度の高さがEMAST発生に重要であることを見いだした。高細胞密度は血管や血流の不足した腫瘍塊内部を反映すると考えれば、腫瘍生理模倣精度が高まったとも言える。3）p53変異のEMAST発生への関与については、EMAST配列での異常の起きやすさと、その後の修復のされ難さを考える必要がある。そこで、p53は野性型だがマイクロサテライト配列異常の修復機能は欠失した細胞株HCT116と、その亜株でp53も欠失したHCT116(p53 null) を用いて、EMAST配列とそれ以外のマイクロサテライト配列での異常発生頻度を調べた。その結果、2つの株ではどちらも低酸素によりEMAST配列での異常頻度が高くなった。つまり、低酸素がEMAST配列での異常を起こり易くし、p53変異はその後の修復を起きにくくする可能性が示唆された。EMAST腫瘍の悪性化機序解明に繋げるべく、現在、p53もしくはその変異が修復にどのように関与するのかを中心に検討している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
計画では、2021年度は、進行大腸癌で頻度の高いp53変異体を用いてのEMAST発生に重要な変異の評価を終えている予定であった。しかし、p53変異体の評価法でもあるEMASTレポーター細胞株作製を優先したことで、p53変異体の作製は完了できていない。加えて、コロナ禍により、研究で必要な遺伝子異常解析試薬の不足や受託解析の受け入れ制限が重なったことで研究期間の延長も必要となった。この点では大きく遅れている。一方で、EMAST誘導培養初期から細胞密度を高く維持すればEMAST誘導効率が増すことを見いだした。これは今後の解析効率向上に繋がる。また、変異体の評価に先んじて、p53変異がEMAST異常の発生よりも修復に関与している可能性も示唆された。これらは、当初計画したアプローチ法とは異なるものの、p53変異に着目したEMAST腫瘍悪性化機構の解明に迫る進捗と言える。したがって、上記の評価とした。
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| 今後の研究の推進方策 |
EMASTの新規検出法の完成を急ぐ。しかし、再現性の高さも担保するには、レポーター細胞株のクローニングは避けられない。目的に適うクローンを慎重に選別する。また、p53変異がどのようにして低酸素性EMAST発生に関わるのかを知ることも、EMAST性進行大腸癌の悪性化機構を明らかにするために欠かせない。「p53変異がEMASTでの異常修復のされ難さに関わる可能性」が示唆されたのは大きなヒントである。レポータークローンの取得と並行して、引き続き、EMAST配列の異常修復にp53変異がどのように関与するのかを検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
コロナ禍による各種消耗品や試薬類の不足が重なったことも加わり、研究に遅れが生じた。それにともない、研究期間の延長も申請した。2021年度に実施できなかった研究計画と該当する経費は翌年度に持ち越す。使途は物品費を主とするが、本研究計画に関連する最新の研究動向や情報を収集する目的で学会年会費や学術集会参加費にも充てる予定である。
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