| 研究課題/領域番号 |
19K09233
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| 研究機関 | 旭川医科大学 |
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研究代表者 |
森 健一郎 旭川医科大学, 医学部, 助教 (70610236)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 分泌タンパク質 / 3MC症候群 / コレクチン |
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| 研究実績の概要 |
3MC症候群は、人種・性別に関係なく発病する、心臓病、二分脊椎症、成長不全、知的障害、口蓋口唇裂等の発達異常が特徴である、常染色体劣性遺伝子疾患である。3MC症候群の原因として、自然免疫の補体活性化に関与するCL-K1、CL-L1、MASP-1/3の遺伝子変異が報告された。CL-K1ノックアウトマウスの表現型解析の結果、マウスはヒト3MC症候群と類似した表現型を示すため、マウスをモデル動物として検討を行っている。
本年度はこれら未知のリガンドを免疫沈降法で同定するため、動物細胞を利用したリコンビナントタンパク質の大量発現系の構築を行なった。トータルRNAを肝臓から精製後、逆転写反応のよりcDNAを合成し、大腸菌-哺乳動物細胞のシャトルベクターに組込み、発現ベクターを作成。その後、哺乳細胞を利用した一過性大量発現システムをで目的タンパク質の発現を試みた。
CL-K1は本来生体内に侵入した異物を認識し、免疫反応を惹起するタンパク質である。この様な機能を持つタンパク質の欠損により胎生期において発達以上が見られるということは、未同定のリガンドが胎生期には存在しており、これらと相互作用することで器官形成に重要な役割を果たしていると想定している。そこで目的タンパク質を大量発現させ、未知の相互作用分子を同定することは、新たな器官形成機序の発見に繋がる重要な意義を持つ。
スモールスケールで予備検討を行った結果、目的タンパク質がコントロールと比較し想定より遥かに少ない量でしか培養上清上に発現していないことが、ウェスタンブロッティングで明らかとなった。その後、発現ベクター量、培養時間、培養温度を検討したが培養上清中に目的タンパク質の分泌亢進は見られず、ほぼ動物細胞内に残ることが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の目的は、本来自然免疫分子として補体系を活性化させるタンパク質コレクチンCL-K1とCL-L1、その相互作用分子であり、セリンプロテアーゼとしての機能を持つMASP-1/3の欠損により、器官形成不全が引き起こされる原因を分子レベルで解明することである。これにより現在明らかになっていない、自然免疫分子を介した未知の器官京成機序を明らかにすることである。
これまでの研究で、CL-K1KOマウスがヒト3MC症候群と非常に酷似した表現型を示すため、病因解明の重要な動物モデルになりうること。本来生体内で自然免疫分子として、細菌やウイルスなどに対し生体防御に関与するこれらの分子が、子宮、羊膜内の胎児という細菌学的に非常に清潔な領域で、胎生期の初期から発現していること。CL-K1が未受精卵期から発現しており、さらに着床、分化、発生の過程で胎生後期になるにつれ発現が亢進すること。器官形成不全の表現型が中胚葉由来の組織に特に大きく現れていることを本研究で明らかにした。
さらに、本来分泌タンパク質と考えられていたCL-K1が培養上清に分泌されなかった。このことは未知の相互作用タンパク質が、細胞内に存在し、細胞内でCL-K1が機能を果たしているという可能性も示唆された。未知の相互作用タンパク質の同定を行うことで、新たな器官形成機序の発見に繋がると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
相互作用分子の特定は、新たな器官形成機序発見に不可欠である。一過性大量発現系の目的タンパク質が細胞外に分泌されていないため、目的タンパク質のN末端にIgG分泌シグナルを持つ発現ベクターの構築を行い、目的タンパク質の大量発現系の構築と精製、免疫沈降法による相互作用分子の同定を試みる。
また、本来のタンパク質が細胞外に分泌されていないことから、細胞内で未同定の機能を持つ可能性も十分に考えられる。そこで、大量発現系の細胞懸濁液を利用した、相互作用分子の特定も試みる。細胞内の相互作用分子の同定は、本来肝臓で転写・翻訳され血液中に分泌されることで、外部から侵入した細菌・ウイルスなどの異物を認識し、自然免疫系を惹起するコレクチンの本来の機能とは全く異なる、新たな機能の発見である。これは、自然免疫分子がなぜ器官形成に関与しているのか、の問いの答えに繋がると考えられる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
目的としていた研究の進捗状況が予定より遅れたため、本年度購入予定であった試薬などの消耗品購入額が減少したため、次年度使用金が生じた。
また、コロナ禍により予定していた、国内学会、国際学会の中止、および大学規定と自己判断による参加自粛のため、学会発表、情報収集などの旅費を使用しなかったため、次年度使用金が生じた。
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