| 研究課題/領域番号 |
19K09325
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
西脇 公俊 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (10189326)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 神経原生肺水腫 / ラット脳死モデル / 気管支肺胞洗浄液 / サイトカイン / 神経ペプチドＹ / 細胞透過性 |
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| 研究実績の概要 |
研究代表者は、ラット神経付き肺潅流標本およびラットフィブリン誘発神経原性肺水腫モデルを用いた検討において、肺交感神経終末でカテコールアミンと共存する神経ペプチドY（NPY）による神経性調節が細胞透過性に関与することを明らかにした。しかしながら、NPYの作用機序については未だ不明なままである。本研究の目的は、in vitro肺細胞透過性評価系を確立し、NPYの作用機序を細胞レベルで明らかにすること、また、「脳死モデルでの神経原生肺水腫に関わる神経ペプチドの同定とVEGFの関与」として、げっ歯類を用いたin vivo脳死誘発肺水腫モデルを確立し、NPYやVEGFの関与の有無を検討するとともに、同モデルを用いて肺水腫の発症を抑制する薬剤を探索することである。本年度は、主としてラット脳死モデルの構築を行った。
全身麻酔したラットを脳固定装置に固定後、露出した頭蓋に脳波計に接続するワイヤーと血栓除去用バルーンカテーテルを挿入する穴を開けた。脳固定を解除し、ラットに気管カニューレを挿入し、人工呼吸を開始した。マウス頭蓋内にバルーンカテーテルを挿入し、バルーン内に生理食塩水を注入することにより頭蓋内圧を上昇させ、脳幹部にヘルニアを起こし、脳死モデルラットを作製した。現在は、安定した肺障害が観察される脳死誘発後の処置時間の検討を行うと同時に、同モデルラットにおける評価項目となる、摘出肺のWet/Dry Ratioの測定法の確立、気管支肺胞洗浄液採取法の確立、気管支肺胞洗浄液中濃度を測定する物質（NPY、VEGF、サイトカイン類）の選定、気管内薬物投与法の確立など、検討を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度は、当初の優先課題であった「脳死モデルでの神経原生肺水腫に関わる神経ペプチドの同定とVEGFの関与」について検討するため、げっ歯類用の脳波測定および血圧測定機器を購入し、脳死モデルラットを構築することから開始した。実際は、同モデル作製に関する報告が少なく、脳死を誘発するまでの手術手技を習得するに留まっており、安定したモデル系確立や評価系の決定には至っていないため、進捗はやや遅れている。
In vitro肺細胞透過性評価系については、系作製のために選定したヒト気道由来株化上皮細胞Calu-3の形成する単層が、安定した物質透過能を示す培養条件を未だ探索中である。そのため、マクロファージ様細胞と肺微小血管内皮細胞を含めた3つの細胞を共培養する肺モデルを未だ確立できていない。また同様の理由で、NPY添加したマクロファージ様細胞の培養上清をCalu-3アッセイ系に添加することによる、NPYの細胞透過性亢進作用の再評価も実施できていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
In vitro検討課題では、ヒト気道由来株化上皮細胞Calu-3が安定した物質透過能を示す単層形成培養条件を確立する。また、マクロファージ様細胞に関して、使用する培地、細胞播種密度、細胞培養期間など検討し、培養条件を確定する。その後、肺上皮細胞、マクロファージ様細胞、肺微小血管内皮細胞の3つの細胞を共培養系にする肺細胞透過性評価系の確立を目指す。また、Calu-3単層に、NPY処理したマクロファージ様細胞の培養上清を添加し、NPYの細胞透過性亢進作用の再評価ならびにNPYのメカニズム解析を行う。
In vivo検討課題では、脳死モデルラット確立に向け、安定した肺障害が観察される脳死誘発後の処置時間の検討を行う。同時に、同モデルラットにおける評価項目となる、摘出肺のWet/Dry Ratioの測定法の確立、気管支肺胞洗浄液採取法の確立、気管支肺胞洗浄液中濃度を測定する物質（NPY、VEGF、サイトカイン類）の選定、気管内薬物投与法の確立、肺傷害の組織学的解析法の確立などの検討を行う。これら検討を完了後には、脳死誘発肺傷害をNPY受容体アンタゴニストの抑制効果の有無を評価すると共に、他の抑制効果を有する薬剤の探索を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
In vivo脳死モデルラット作製における手術手技習得が主となり、進捗が遅れ未達成の検討事項が多くなった。さらに、予定していた出張も新型コロナの影響で中止となり、旅費の使用がなかったため、次年度使用額が生じた。現在未達成の検討事項を含め、今後の研究推進方針に則ってin vitro（セルカルチャーインサート、培地、血清、試薬等の購入）とin vivo（動物、試薬、アッセイキット、生化学分析装置用カートリッジ、抗体等の購入）の実験を行うことにより、交付額相当の経費が必要となる。
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