| 研究課題/領域番号 |
19K09386
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| 研究機関 | 関西医科大学 |
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研究代表者 |
竹下 淳 関西医科大学, 医学部, 研究医員 (40433263)
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| 研究分担者 |
中嶋 康文 関西医科大学, 医学部, 教授 (70326239)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | microRNA / 敗血症 / 血小板 |
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| 研究実績の概要 |
miRNAの網羅的解析による敗血症における血小板が関与する機序を検証するためヒト正常血小板及び、培養細胞用いた以下の実験系（In Vitro）を施行した。
健康成人の被験者の末梢静脈から、1回20ｍｌの採血を行った。a.miRNAの分離と濃縮 クエン酸採血後、遠心操作にて多血小板血漿作成後、洗浄血小板溶液の作成。血小板内miRNA変化を観察する目的で、敗血症病態の主因となるリポ多糖体、ヒストン、HMGB1等の DAMPs投与前後の洗浄血小板検体から、mirVana miRNA Isolation Kit 等を用いてmiRNAを抽出。b.包括的miRNAの発現プロファイリング 次に、定量性のある網羅的miRNAプロファイリングを、従来のマイクロアレイより優れた次世代高速シーケンサーIon PGMシステム (Life Technology社) を用いて絶対的な定量法を施行。１．Small RNAのライブラリ作成 Ion TotalRNA-Seq Kitを用いてフラグメント化 ２．cDNAに変換 逆転写酵素を用いる。３．ビース調整（４時間）エマルジョンPCR法を用いて、cDNAを増幅 ４．シーケンシング（３時間） シーケンサーによるmiRNA発現定量 ５．データ解析（１時間）サーバーにSFF FASTQ形式のデータが転送される。統計学的な有意差検定を伴う発現定量解析には、CLCバイオ社の解析ソフト（Genomic Work Bench）を使用した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
コロナ禍で、勤務時間に制限がかかったり、実験消耗品の納入が遅れることもあった。また、一部の実験内容を、外部委託しているが外部委託会社の勤務時間が短縮しているため、実験が部分的に遅れている。
また、予定してた敗血症患者を対象とした臨床研究においても、遅れがある。
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| 今後の研究の推進方策 |
敗血症患者(In vivo)における血小板miRNAの解析を遂行
検証実験
Real Time-PCRでのmiRNA発現差確認
miRNAの標的mRNAがコーディングするタンパクの定量
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| 次年度使用額が生じた理由 |
コロナ禍の影響で遅延している研究実績の概要で記入した培養細胞を用いた実験系の追加実験を施行するために、今年度に繰り越した研究資金を使用する必要がある。
また臨床研究を、以下の計画で次年度に予定しているためにその研究資金が必要となる。
敗血症患者の末梢血から洗浄血小板溶液を、作成し細胞培養系（In Vitro）で有意に変化のあったmiRNAの発現miRNAの発現、ターゲット遺伝子、タンパク質発現をリアルタイムPCR法、およびウエスタンブロット法で解析する。
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