| 研究課題/領域番号 |
19K09386
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| 研究機関 | 関西医科大学 |
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研究代表者 |
竹下 淳 関西医科大学, 医学部, 研究医員 (40433263)
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| 研究分担者 |
中嶋 康文 関西医科大学, 医学部, 教授 (70326239)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 敗血症 |
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| 研究実績の概要 |
miRNAの網羅的解析による敗血症における血小板が関与する機序を検証するためヒト正常血小板及び、培養細胞用いた以下の実験系（In Vitro）を施行した。
健康成人の被験者の末梢静脈から、1回20ｍｌの採血を行った。a.RNAの分離と濃縮 クエン酸採血後、遠心操作にて多血小板血漿作成後、洗浄血小板溶液の作成。血小板内miRNA変化を観察する目的で、敗血症病態の主因となるリポ多糖体、ヒストン、HMGB1等の DAMPs投与前後の洗浄血小板検体から、miRNA Easy Mini Kit 等を用いてTotal RNAを抽出した。b.包括的miRNAの発現プロファイリング 次に、定量性のある網羅的miRNAプロファイリングを、従来のマイクロアレイより優れた次世代高速シーケンサーIon PGMシステム (Life Technology社) を用いて絶対的な定量法を施行。１．Small RNAのライブラリ作成 Ion TotalRNASeqKitを用いてフラグメント化 ２．cDNAに変換 逆転写酵素を用いる。３．ビース調整（４時間）エマルジョンPCR法を用いて、cDNAを増幅 ４．シーケンシング（３時間） シーケンサーによるmiRNA発現定量 ５．データ解析の順で行った。
しかし、次世代シーケンサーの性能が悪いためか、実験結果が芳しくなかったため、外部委託業者に、次世代シーケンサーによるmRNAおよびmiRNAの網羅的発現解析を依頼した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
コロナ禍で、勤務時間に制限がかかったり、実験消耗品の納入が遅れることもあった。また、一部の実験内容を、外部委託しているが外部委託会社の勤務時間が短縮しているため、外部委託の実験が遅れた。また予定していた敗血症患者を対象とした臨床研究においても、開始することができなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
依頼していた外部委託業者に、次世代シーケンサーによるmRNAおよびmiRNAの網羅的発現解析を行い、有意差のあったRNAを選別する。
その後、敗血症患者の末梢血から洗浄血小板溶液を作成し、細胞培養系（In Vitro）で有意に変化のあったmiRNAの発現miRNAの発現、ターゲット遺伝子、タンパク質発現をリアルタイムPCR法、ウエスタンブロットで解析する。一部の解析は外部委託業者に依頼する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
以下の研究計画のために、高額の研究資金が必要なために次年度に残した研究資金を使用する。依頼していた外部委託業者に、次世代シーケンサーによるmRNAおよびmiRNAの網羅的発現解析を行い、有意差のあったRNAを選別する。その後、敗血症患者の末梢血から洗浄血小板溶液を作成し、細胞培養系（In Vitro）で有意に変化のあったmiRNAの発現miRNAの発現、ターゲット遺伝子、タンパク質発現をリアルタイムPCR法、ウエスタンブロットで解析する。、次世代シーケンサーによる網羅的解析は外部委託業者に依頼する予定である。
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