| 研究課題/領域番号 |
19K09402
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| 研究機関 | 奈良県立医科大学 |
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研究代表者 |
川井 廉之 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (90445073)
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| 研究分担者 |
中山 章文 岐阜医療科学大学, 保健科学部, 教授 (70536721)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 敗血症 / 迅速診断 / 16SrRNA / PCR |
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| 研究実績の概要 |
敗血症の原因菌の同定には現在の検出方法では迅速性に欠ける。これには、現在の検出方法の多くで、細菌の増殖能に依存した培養による前処理が必要であることが一つの原因である。敗血症症例から得られた血液サンプルから迅速に原因菌を分子生物学的アプローチによって同定できない理由の一つは原因菌のDNA量と比較して、圧倒的多数存在するヒト遺伝子由来のDNAに対する非特異的反応があげられる。本研究の目的は、敗血症患者からえら得た血液サンプルから迅速に原因菌するために、培養による増菌の過程を経ずに、直接原因菌の遺伝子を増幅する手法の確立を行うことである。
令和2年度までに非特異的反応の抑制と細菌DNAの検出感度を高める実験系の確立を進め、ヒトDNAを背景とした場合の感度への影響を評価した。これを敗血症の代表原因菌であるE.coli, S. aureus, P. aeruginosaのDNAと混合検体について検証を行った。ここまでの実験経過について、プライマーデザイン方法の工夫と細菌DNAの非特異的反応の抑制した実験系における検出限界についての報告を、国内学会において報告した。
令和3年度は、令和2年までに確立した実験条件における成果の論文原稿の作成を行った。また、確立した実験系の検出感度の検証に必要である、本研究用に収集した敗血症人血液サンプルの前処理を行った。このうち、一部のヒトサンプルに対する検証実験を行った。この過程で明らかとなった実験系の課題について実験方法の見直しを行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
前年度に作成したオリジナルにデザインしたユニバーサルプライマーに対して、3種に菌種に対して検出限界濃度の確認を行い良好な結果を得ている。また、ヒト遺伝子を背景とし
たモデルを作成し、概ね良好な結果を得ている。現在、一部の検出限界が不十分な細菌に対して、さらに検出感度向上のための実験系の見直しを行っている。実験系の改善中であり、本研究の目的で収集したヒト敗血症サンプルについての検証が実施できていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
検出感度の改善方法を検証を進める。臨床検体に対する検出限界性が、従来の培養法の検出感度と同程度と考えられる検出感度が確立されしだい、ヒト敗血症サンプルに対する検証を進める。また、上記結果をすみやかに論文発表による発信を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
検出感度向上の途中で、本研究によって増幅された細菌DNAの解析手法が別に確立されたため、連続した検出系となるように実験系に追加の修正が必要となった。
次年度では、これまでに使用していなかった試薬を用いた調整を中心に検出感度の検証を行う予定である。
また、論文投稿に時間を要しており、現在投稿に向けた準備を進めている。
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