2019 年度実施状況報告書

新規ウイルス投与法によるALS局所モデルと治療法の探索:TDP43断片化の病理

研究課題

研究課題/領域番号	19K09532
研究機関	琉球大学
研究代表者	神里興太琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10554454)
研究分担者	垣花学琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20274897)
研究期間 (年度)	2019-04-01 – 2022-03-31
キーワード	筋萎縮性側索硬化症ラットモデル / 軟膜下投与
研究実績の概要	本年度、１）．断片化tranactive response DNA binding protein of 43kDa（TDP-43）を神経細胞においての誘導するためのウイルスベクターの作成、２）ラット軟膜下投与によるTDP-43断片化C末端遺伝子導入と電気生理学的評価、という２つの計画に関し以下の検討を行なった。１）「TDP-43断片化C末端遺伝子を神経細胞においての誘導するためのウイルスベクターの作成」のためにsynaptophysinをプロモーターとしてアデノ関連ウイルスセロタイプ９を作成した（AAV9-syn-pTDP43）。ヒト神経芽細胞腫培養細胞を用いた遺伝子発現実験およびタンパク発現実験のためにユビキチンをプロモーターとしたウイルス（AAV9-UBI-pTDP43）を作成し、その発現を検討した。pTDP43-mRNAが上昇していることを確認できた。一方、ウェスタンブロッティングによるタンパク発現を確認した。今後、ラット初代神経培養細胞におけるAAV9-Syn-pTDP43による遺伝子導入効率に関して確認する予定である。２）「ラット軟膜下投与によるTDP-43断片化C末端遺伝子導入と電気生理学的評価」のために、予備実験として緑色蛍光たんぱく（GFP）を誘導する実験を実施した。そのためのコントロールウイルスとしてアデノ関連ウイルスセロタイプ９を作成した（AAV9-Syn-GFP）。作成したAAV9を野生型SD系ラット脊髄に軟膜下投与した。投与後6-8週後における免疫組織学的検討でGFPの強力な発現を確認できた。今後は、作成したAAV9-Syn-pTDP43を軟膜下に投与し、タンパク発現と神経細胞死の組織学的評価、さらに電子生理学的評価を行う計画である。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由 AAV9（AAV9-UBI-pTDP43 / AAV9-Syn-pTDP43 / AAV9-Syn-GFP）の作成とその評価に関しては問題なく実施できている。また、手術としてラット軟膜下ウイルス投与に関しても手技的な問題は生じておらず、このまま検討を継続して問題はない。１）「TDP-43断片化C末端遺伝子を神経細胞においての誘導するためのウイルスベクターの作成」のためにAAV9-UBI-pTDP43およびAAV9-syn-pTDP43を作成した。ヒト神経芽細胞腫培養細胞を用いた検討でpTDP43の発現を検討した。今後、ラット初代神経培養細胞におけるAAV9-Syn-pTDP43による神経に対する遺伝子導入効率に関して確認する予定である。２）「ラット軟膜下投与によるTDP-43断片化C末端遺伝子導入と電気生理学的評価」のために、予備実験として緑色蛍光たんぱく（GFP）を誘導する実験を実施した。そのためのコントロールウイルスとしてアデノ関連ウイルスセロタイプ９を作成した（AAV9-Syn-GFP）。作成したAAV9を野生型SD系ラット脊髄に軟膜下投与した。投与後6-8週後における免疫組織学的検討でGFPの強力な発現を確認できた。今後は、作成したAAV9-Syn-pTDP43を軟膜下に投与し、タンパク発現と神経細胞死の組織学的評価、さらに電子生理学的評価を行う計画である。これまでのG93Aマウス等トランスジェニック動物における検討から120-150日の観察が必要であると考えられる。また、電気生理学的検討を実施していくための予備実験を早期開始する予定である。その予備実験として、筋攣縮を生じるラットモデルとして高位胸髄横切断モデルを使用する予定である。このモデルに関しては研究代表者に作成実績があり、技術的問題はない。
今後の研究の推進方策	当初の計画通りに研究を推進する予定である。ウイルス作成に関して、その感染効率に関しての検討を初代神経培養系において検討する。初代神経細胞採取・培養技術は当施設において確立しており問題はない。動物モデルにおける検討に関して、今後は作成したAAV9-Syn-pTDP43を軟膜下に投与し、タンパク発現と神経細胞死の組織学的評価、さらに電子生理学的評価を行う計画である。電気生理学的検討を実施していくための予備実験を早期開始する予定である。その予備実験として、筋攣縮を生じるラットモデルとして高位胸髄横切断モデルを使用する予定である。このモデルに関しては研究代表者に作成実績があり、技術的問題はない。