| 研究課題/領域番号 |
19K09543
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
榎本 光裕 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 非常勤講師 (90451971)
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| 研究分担者 |
辻 邦和 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 寄附講座准教授 (20323694)
大川 淳 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (30251507)
平井 高志 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (40510350)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 神経障害性疼痛 / 末梢神経損傷 / 後根神経節 |
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| 研究実績の概要 |
最初に遺伝子改変マウスの準備を行った。Thy1-YFP Tgマウス、Sox10-Venus マウスを入手し、同マウスを潅流固定し、腰部後根神経節（DRG）切片を作製した。蛍光顕微鏡で観察するとDRGニューロンにYFP陽性が確認できたが、細胞によって不均一なYFP発現を呈していた。一方、Sox10-Venus マウスDRGでは周囲に蛍光タンパクVenusを発現した細胞が明瞭に確認できた。同マウスを使用して神経障害性疼痛（SNI）モデルを作製した。機械刺激を用いた感覚検査を実施すると過去の報告と同様に損傷1週で知覚過敏となり、3週以降は過敏状態が継続した状態であった。
また、FACS Verse systemを用いて、マウス腰部後根神経節（DRG）ニューロン、グリア細胞のソーティングを実施した。Thy1-YFP Tgマウス、Sox10-Venus マウス、対照群としてC57BL/6マウスを準備した。最初にC57BL/6マウスDRGに酵素処理（コラゲナーゼP）を実施して単一細胞を得た。その後、ニューロン、グリアに対する抗体を用いて細胞免疫染色を実施した。その後、ソーティングを実施したところばらつきがおおいもののニューロン1に対してグリアは平均10個程度となった。マウスの場合、組織学的にDRGニューロン1個あたり平均5.5個のサテライトグリアが観察されている（Ledda et al. Tissue Cell. 2004）。本実験では、サテライトグリアの割合が従来の報告より2倍高い結果であった。Thy1-YFP Tgマウス、Sox10-Venus マウスを使用したソーティングも実施したが、YFP蛍光強度が不均一であったり、Venus蛍光強度が強すぎたり、対照群の設定を調整する必要があった。遺伝子改変マウスを用いた安定したソーティング技術の確立を次年度の課題としている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
C57BL/6マウスDRGからの単一細胞の分離に使用する薬剤の比較検討に時間を要した。過去に報告されている非酵素（HBSS/HEPES）、酵素（パパイン）処理を行って細胞単離を試みた。しかし、分離処置後にFACSを実施すると細胞塊が含まれており、均一な細胞が得られなかった。過去にラットDRG単離に使用されたコラゲナーゼPをテストしたところ細胞死は少なく、比較的容易に均一細胞が得られた。以降、同解析方法が確立され、実験が進むようになった。
C57BL/6マウスDRGでのソーティングは改善されたが、遺伝子改変マウスDRGのFACSは蛍光強度の調整が難しく、正確な定量ができなかった。Sox10-Venus マウスの場合、サテライトグリアの指標となるVenusの蛍光強度が強く、DRGニューロンも陽性と判定されてしまう状況であった。対照群の設定や細胞分離方法に関してさらなる改良が必要であった。
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| 今後の研究の推進方策 |
疼痛慢性期における非神経細胞の形態変化：SOX10-Venusマウスを用いて左腓腹神経を切断した神経障害性疼痛モデルを作製する。両側のDRGを採取して、健患側の蛍光強度の違いを組織学的に比較する。損傷前、1週後、3週後の3群に分けて解析を行う。さらに神経細胞、SGC、血管内皮について免疫染色を行い、細胞種を同定し各細胞数、形態を組織学的に解析する。
腰部DRGに対する細胞ソーティング：今回課題とした遺伝子改変マウスを用いたFACS技術の向上を目指す。偽陽性とならないよう細胞分離手技を正確に行い、対照群（C57BL/6）マウスと比較することで陽性細胞率を解析する。SOX10-Venusマウスではサテライトグリアに蛍光発現を認める。損傷前と損傷後1週、3週での蛍光強度を比較することで慢性疼痛時でのニューロンとサテライトグリアの細胞数を定量する。ニューロン/グリアの割合変化をみることで神経障害性疼痛慢性期でのサテライトグリアの役割を明らかにする。
腰部DRG非神経細胞でのmRNA発現：ソーティングした細胞からRNAを抽出し、過去に報告した候補遺伝子プロファイルからプライマーを設計し、RT-PCRによる解析を行う。各損傷モデルで共通して発現増加（健側より1.5倍以上）がみられる遺伝子を同定する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
実験動物の購入、飼育費用が主となっている。モデル作製や行動解析は、すでに購入した物品もあり比較的安価で実行できた。多くのサンプルを採取したが、冷凍保存しているものも多い。FACS解析に伴う試薬、抗体は既存製品の使用も可能で分子生物学試薬の消耗品が少なかった。
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