| 研究課題/領域番号 |
19K09543
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
榎本 光裕 東京医科歯科大学, 東京医科歯科大学病院, 非常勤講師 (90451971)
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| 研究分担者 |
辻 邦和 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, ジョイントリサーチ講座教授 (20323694)
大川 淳 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (30251507)
平井 高志 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 講師 (40510350)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 神経障害性疼痛 / 末梢神経損傷 / 後根神経節 |
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| 研究実績の概要 |
昨年に引き続きワイルドタイプマウスを使用した神経障害性疼痛モデル（spared nerve injury：SNI）を作製した。末梢神経損傷亜急性期から慢性期でのDRGニューロン、サテライトグリア(SGC)の変化を解析し、その役割について検討した。
モデル作製後1週、3週、6週にパラホルムアルデヒドで潅流固定し、損傷および健側を含めて第3(L3)、第4腰部(L4)DRGを単離し、凍結切片を作製した。ニューロンに対して抗ＮeuＮ抗体 、SGCに対して抗Glutamine synthetase（Gl Syn）抗体を用いて二重免疫染色し、5切片ですべての陽性細胞数を計測した。損傷対側での陽性数を100％として患側の割合を計算した。
組織解析の結果、NeuN陽性細胞数は損傷１週間で減少し、６週後も減少したままであった。L3DRGでの減少割合は少なく（１週：85%、３週：82%、６週：78%）、L4DRGで多かった（１週：86%、３週：71%、６週：74%）。Gl Syn陽性細胞数は、損傷１週で陽性細胞が増加し、３週で低下、６週では健側と同等レベルとなっていた。L3DRG（１週：167%、３週：137%、６週：105%）よりもL4DRG（１週：190%、３週：134%、６週：91%）での割合変化が強かった。
マウスSNIモデルでは損傷１週で足底の知覚過敏が顕著となり、以降から継続した過敏状態となる（Hirai et al. Mol Ther 2014）。本結果による損傷１週目でのSGC増加が慢性疼痛初期過程に関与している可能性が示唆された。一方、ニューロンは経時的に減少しており、ニューロン自身の変化が疼痛慢性化に関与しているかもしれない。今後、ニューロン・SGCのシグナル連関について明らかにしていく必要がある。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
新型コロナ対策のまん延防止等重点措置によって研究参加制限や学会活動制限の影響も大きく、実験に必要な新規手法の獲得や遺伝子改変マウスの繁殖が不十分であった。しかし、ワイルドタイプマウスを使用した神経障害性疼痛モデルの作製は継続して実施している。行動学的検査、組織単離、切片作製は安定して実施できている。免疫染色による組織解析で神経障害側でのDRGニューロンの減少とサテライトグリアの増加が確認できた。経時的に組織学的解析をすすめることでニューロン周囲のサテライトグリアの増加が慢性疼痛初期過程に関与している可能性があることがあきらかとなった。シュワン細胞に蛍光色素が発現するSOX10-Venusマウスは現在、繁殖に成功しており、最終年度に向けて調整している。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度実施できなかったDRGからサテライトグリアを単離して慢性疼痛初期過程に関与する遺伝子を同定する。、シュワン細胞に蛍光色素が発現するSOX10-Venusマウスを用いて神経障害性疼痛モデル作製、1週間後にDRGを単離してFACSシステムを利用してソーティングを行う。細胞からRNAを抽出し、過去に報告した候補遺伝子プロファイルからプライマーを設計し、RT-PCRによる解析を行う。正常側と損傷側で比較することでサテライトグリアに発現する神経障害に特異的なマーカーを探索する。
特異的なマーカーが特定できた場合、ヘテロ核酸（HDO）を作製して、疼痛慢性期に静脈あるいはクモ膜下注射によってサテライトグリアでの遺伝子制御を行う。HDO投与前後、経時的に行動学的評価を行うことで有効性を確認する。
一定の成果に対して学会発表および論文作成をおこなう。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
実験動物の購入、飼育費用が主となっている。モデル作製や行動解析は、すでに購入した物品もあり比較的安価で実行できた。多くのサンプルを採取したが、冷凍保存しているものも多い。免疫組織染色に伴う試薬、抗体は既存製品の使用も可能で分子生物学試薬の消耗品が少なかった。また、新型コロナ対策のまん延防止等重点措置によって研究参加制限や学会活動制限の影響も大きかった。
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