| 研究課題/領域番号 |
19K09574
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| 研究機関 | 三重大学 |
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研究代表者 |
辻井 雅也 三重大学, 医学部附属病院, 講師 (40444442)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | デュピュイトラン拘縮 / 筋線維芽細胞 / マイクロリボ核酸 |
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| 研究実績の概要 |
デュピュイトラン拘縮（DD）は手掌腱膜の肥厚と短縮により手指屈曲位を呈する原因不明の疾患である。治療は肥厚した腱膜の外科的切除か、コラゲナーゼ注射による酵素溶解療法がある。しかしいずれの治療法でも、比較的高い再発率が報告されており、実際に注射後5年で47%の再発が報告され、再発の克服はDD治療の次の課題である。
DDの病態は拘縮索に認める特殊な線維芽細胞である筋線維芽細胞（myofibroblast: MF）が主因と考えられており、本研究の目的はこのMF分化を抑制する新たな治療方法を検討することである。MFは拘縮索の中でも結節部に多く存在するが、その起源は束部にもあると考えている。その理由として手術では結節部は必ず切除するため、再発には切除腱膜の断端で線維芽細胞の活性と分化が必要と考えるからである。先行実験で線維化促進因子であるthrombinが結節部だけでなく束部由来再細胞でもMF分化の促進を認め、また遊走能やROS産生も増大させることも示した。そこで治療標的の一つとしてthrombinの抑制に関して実験を行う。
また先行実験で遺伝子調節に重要なmicro RNA (miRNA)に対してarray解析をDD拘縮索の結節部と束部、また正常コントロールの3群で行い、miR-204とmiR-21の2遺伝子を同定した。この2遺伝子のうち、miR-21は一般のmiRNAとは異なり、高発現で疾患を促進する特殊なmiRNAでantagomir（拮抗遺伝子）の投与での間質の線維化抑制や心機能改善が報告されている。miR-21のDD拘縮索での発現を評価し、miR-21のantagomir投与でのMF分化抑制効果について実験を行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
In vitroの実験ではDupuytren拘縮（DD）索の結節部と束部由来細胞を用いて行った。Thrombin 1U/mlを添加して、Western blottingでα-SMA発現が束部由来の細胞では約3倍に増加した。次にthrombinの阻害薬であるargatrobanを用いて実験し、それによりthrombin投与でのα-SMA発現の増加が有意に抑制された。またscratch assayでの遊走能やDCF-DA assayでROS産生の増加を抑制することも示し、thrombin阻害が再発予防や病態進行の抑制に寄与する可能性が示唆された。またthrombinの起源について外科的治療や注射治療後では出血に伴うと考えられるが、慢性期では組織因子（tissue factor: TF）の関与を考えた。TFは脳や子宮、腎臓などで高発現するが、腱膜など結合組織での発現は乏しいと報告される。現在のところ、予備実験的に2例の切除標本で免疫組織化学的評価を行い、2例ともに結節や血管の細胞と間質で発現を確認した。今後、対象数を増やして検討する。
miRNAの解析はmiR-21の発現と局在をin situ hybridization（IHS）にて評価した。miR-21は主に結節部の細胞で発現しており、80.0%の細胞で発現していた。一方、束部では15.0%に陽性細胞を認めた。またmiRNAのオンラインデータベースではTGF-betaのtarget scoreは98/100で、TGF-betaに関連した作用が考えられる。TGF-betaの投与は24時間でα-SMA発現を束部では約10倍、結節部でも約8倍と著明に増大させた。現在、miR-21のantagomir（拮抗遺伝子）導入の効果を検討しているが、PCRによるantagomirの導入効率が不安定であり、この実験系はやや遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
先に述べたmiR-21のantagomir（拮抗遺伝子）の導入であるが、まず導入効率をPCRで評価したが、発現のばらつきが強いために解釈が困難で、RNU6で補正して検討しても結果の解釈は困難であった。そのため導入効率の検討を行わずに、miR-21 antagomirの効果をWestern blottingにてα-SMA発現を、またMTS assayにて細胞増殖能を、scratch assayにて遊走能を評価する予定である。また線維化の進行に重要な役割を果たすROS産生についてもDCF-DA assayで評価するが、これらの実験手技は、これまでに行ったthrombin添加の効果検討で確立しており、問題ないと考えている。
また細胞レベルでのthrombin単独での病態への影響と、thrombin阻害剤であるargatrobanの筋線維芽細胞（MF）への効果をin vitroで確認できたために、thrombinの起源として組織因子（TF）の発現に関する検討を追加して論文化する予定である。さらにmicroRNA array解析から正常組織と統計経学的に差を認めたmiR-4299がTFの標的miRNA（score 96）であるために、こちらも追加で検討を加えたいと考えている。
miRNAに関しては、本来は抑制系に機能するために、病態の主体である結節部で発現が低いものが重要と考えられる。そのため我々のアレイ解析で唯一同定されたmiR-204に関する切除標本でのin situ hybridizationについて再度検討を行う予定である。先行実験においては結節部に発現が低いことを予想したものの、実際には結節部に強く発現していた。しかしながら束部での発現も認めており、細胞レベルでの影響についても検討を行いたいと考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
先行実験のmicro RNA (miRNA) array解析においてDupuytren拘縮 (DD)の拘縮索の結節部と束部、また正常コントロールの3群の比較から同定した遺伝子で抑制系に機能するのはmiR-204のみであり、当初の研究計画ではこのmiRNAがDDの病態進行や再発抑制への可能性を強く期待した。しかしin situ hybridizationでは抑制されていると考えた拘縮索結節部においても高発現であったことから、治療候補にし難いと判断した。そのため当初の計画におけるin vitro研究でのmiR-204の遺伝子導入の実験は行えておらずその購入がなかったために費用が少なかった。
しかしmiRDBにおいてmiR-204は線維化の病態シグナルにおける主因であるSMADを標的としており、今後の研究の推進方策でも述べたが、条件を変更してin situ hybridizationを行いたい。さらにthrombinの病態関与に関する実験結果を論文化したいと考えており、thrombinの起源と考える組織因子の添加実験の追加や、関連するmiRNAに対しても検討を行う予定である。またコロナ禍のために国内、海外の学会への参加ができれおらず、状況を鑑みてではあるが積極的な意見交換を行う予定である。
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