| 研究課題/領域番号 |
19K09625
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
藤田 洋史 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (20423288)
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| 研究分担者 |
小渕 浩嗣 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 講師 (10304297)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 破骨細胞 / ゲノム編集 |
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| 研究実績の概要 |
私たちは、破骨細胞特異的に発現する複数の受容体群を、in silico解析にて明らかにしており、これらの中に骨の鮮度を認識する受容体があると仮説を立てている。
本年度は、マウス胚において、これらの受容体の内の１群（Gene A, Gene B, Gene C）のTriple KOを、CRISPR-Cas9 systemを用いたゲノム編集により試行した。CRISPRdirect softwareにて、各遺伝子に特異的なgRNAをそれぞれデザインした。C57BL/6マウス1細胞期胚50個を用いて、Cas9タンパク質とgRNAの複合体をエレクトロポレーションにより導入した。そのうち、胚盤胞期まで発生する胚は2個であった。胚これらのゲノムDNAを精製し、シークエンシングにより解析した結果、Gene A、Gene Bに変異が導入されていることを確認した。しかし、Gene Cについては変異が認められなかった。一方、BDF1マウス胚においても同様に行ったが、胚盤胞期まで発生する胚は認められなかった。CRISPR-Cas9 systemによるマウス胚ゲノム編集は、両アリルに高効率に変異が導入される。そのため、ターゲット遺伝子が発生に関与する場合、系統の樹立が困難となる。本年度の研究結果より、少なくとも2遺伝子については、初期発生に影響がないことを明らかにできた。
一方で私たちは、既に候補分子の一つGene Dについて、KO系統を樹立している。本年度は、このGene DのKOマウスとHeteroマウスについて、卵巣摘出による骨粗鬆モデル作製し、HeteroマウスとKOに有意な差がないことを証明した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
すでに樹立した候補遺伝子KOマウスの骨解析が進んでおり、新たな候補遺伝子のマウス胚におけるゲノム編集も可能であり、初期胚発生に影響ないことも明らかにできたため。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後はTriple KO処理による毒性を考慮して、マウス胚におけるゲノム編集は、ターゲットを2箇所以下に絞る。他の候補遺伝子群についても、マウス胚にて、ゲノム編集処理を行い、偽妊娠マウスへの移植、F0マウスのジェノタイピング、系統樹立後の骨粗鬆症誘導と酸化ストレス誘導、大腿骨のCT解析を行い、鮮度認識受容体候補分子の機能解析を順次行う予定である。また、系統樹立したGene Dについては、OVXしたWTとKOマウスの大腿骨のCT解析と組織学的解析を行い、骨への影響を明らかにする予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
胚培養費用を節約できたため次年度使用額が生じたが、前述のようにTriple KOは困難なため、ゲノム編集マウス作製数は予定より増えると見積もっている。そのため、試薬費用などが増える予定であり、次年度へ繰り越して、これに充てることとした。
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