| 研究課題/領域番号 |
19K09641
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
矢野 文子 東京大学, 医学部附属病院, 特任准教授 (80529040)
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| 研究分担者 |
大島 寧 東京大学, 医学部附属病院, 准教授 (50570016)
谷口 優樹 東京大学, 医学部附属病院, 特任准教授 (80722165)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 変形性膝関節症 / ルブリシン / 関節軟骨最表層 |
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| 研究実績の概要 |
本年度はPrg4CreERt2マウスにRosa26-tdTomato (Ai14)とこれまでに我々のラボで同定してきた、変形性膝関節症（OA）に関わる分子のfloxマウスを掛け合わせている。
骨・軟骨分化に必須であり、接着分子のひとつである、βcatenin floxマウス、低酸素誘導分子であるHif2floxマウス、炎症性シグナルのNFkapppaBの下流分子であるRela floxを掛け合わせることで、Prg4発現細胞はTomatoカラーで識別され、かつ、Prg4発現領域において、βcatenin、Hif2、Relaの発現がノックアウトされるマウス系統を作出した。それら３つの系統マウスに変形性膝関節症モデル（DMMモデル）を作成し、初期変形性膝関節症発症に関わるメカニズムを組織学的解析（蛍光免疫染色）を行った。これらのマウスでは仮説のとおり、Prg4発現特異的βcateninもしくはHif2のノックアウトマウスではOAの発症が抑制された。Prg4CreERt2；Relafloxマウスは現在解析中である。
In vitroの解析でもこれらのマウスを用いて、Prg4発現特異的βcateninもしくはHif2ノックアウト成体マウスの関節軟骨最表層の細胞を単離し、下流のシグナル探索のためにRNAシークエンスでの解析を進めている。これまでにPrg4の発現を上げる分子はβcatenin-CREBシグナルであることが示唆されているため、入手できるWNTシグナルのリガンドを用いて、Prg4の発現を確認している。もし、Prg4の発現をあげることのできるリガンドもしくはそのシグナルを活性化させるアゴニスト、化合物を同定できれば、初期変形性膝関節症発症を防ぐことのできる治療薬の開発につながる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
Prg4発現を制御する遺伝子群をいくつか候補を絞り込むことができ、Prg4発現領域において、βcatenin、Hif2、Relaの発現がノックアウトされ、かつ、Prg4発現細胞はTomatoカラーで識別されるマウス３系統を作出し、OAモデルマウスの検討を行うことができた。
当研究室では様々なシグナルの転写因子、分子のfloxマウスを持ち合わせているため、すぐに掛け合わせることができ、解析に進むことができた。解析方法としては、組織学的解析（免疫染色、サフラニンO染色）と3Dコンフォーカルを用いた定量的解析技術で関節表層全体におけるPrg4発現細胞のOAモデルにおけるPrg4の発現変化を解析する
現在は、これらのマウスを用いて、関節軟骨最表層の細胞を単離し、RNAシークエンスでの解析を進めている。
特にWNTシグナルについてはアゴニスト化合物、リガンドが購入できるため、現在、WNTシグナルを活性化させ、Prg4発現を誘導するものを探索し、治療候補薬として絞り込んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
2021年度は最終年度として、、Prg4発現特異的βcatenin、Hif2、Relaノックアウト成体マウスの解析を進め、これら成体マウスの関節軟骨最表層の細胞を単離し、RNAシークエンスで得られた情報をデータ解析し、Prg4遺伝子発現制御に関わるシグナル・分子メカニズムの解明を行う。さらに、変形性膝関節症治療候補薬の探索として、Prg4発現上昇に関連するタンパク、アゴニスト、低分子化合物として入手できるものをIn vitroで検討する。In vitroの結果から、同定された候補治療薬をPrg4CreERt2; Tomato flox変形性膝関節症モデルマウスに投与する。Prg4発現細胞はTomatoカラーで標識することができるので、組織学的解析と3Dコンフォーカルを用いた定量的解析技術で解析する。これらの結果を論文化にする予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
最終年度である2021年度にRNAシークエンス解析、論文投稿を予定しているため、大きな支出を予定しているため
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