| 研究課題/領域番号 |
19K09646
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
松下 雅樹 名古屋大学, 医学系研究科, 特任助教 (60721115)
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| 研究分担者 |
鬼頭 浩史 あいち小児保健医療総合センター(臨床研究室), 臨床研究室, 副センター長 (40291174)
三島 健一 名古屋大学, 医学部附属病院, 講師 (40646519)
長田 侃 名古屋大学, 医学部附属病院, 医員 (80815324) [辞退]
神谷 庸成 名古屋大学, 医学部附属病院, 医員 (50845542)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | メクロジン / 軟骨無形成症 / FGFR3 / 低身長 |
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| 研究実績の概要 |
乗り物酔い防止薬の成分であるメクロジンは軟骨細胞において線維芽細胞増殖因子受容体3（fibroblast growth factor receptor 3 : FGFR3） シグナルを抑制し、軟骨無形成症（achondroplasia：ACH）マウスモデルへの経口投与により骨伸長促進効果が認められている。これまでの研究で、7日齢のACHマウスモデル（Achマウス）に10日間メクロジンを投与したところ、1および2 mg/kg/dayで濃度依存性に骨伸長を促進したが、20 mg/kg/dayでは有効性が認められなかった。令和1年度は、4および8 mg/kg/dayをAchマウスに同様のプロトコールで投与し骨長を評価したところ、本プロトコールにおいてはメクロジン2 mg/kg/dayが、副作用が少なく最大限骨伸長効果を発揮できる用量と考えた。令和2年度は、メクロジン2 mg/kg/dayの有効性を検証するためにHypマウスの骨幹端部の骨梁および骨幹部の骨皮質のosteoid volume/bone volume (OV/BV) を定量した。メクロジン2 mg/kg/dayはHypマウスのOV/BVを有意に減少させた。また、メクロジンはHypマウスの成長軟骨の構造を改善した。さらに、メクロジンはHypマウスの血清カルシウムおよびリン値を有意に上昇させた。
メクロジンの作用機序の検討について、令和1年度にcell freeキナーゼアッセイを行ったところ、メクロジンはMAPKカスケードにおけるMAP3K3のリン酸化を抑制することが示唆された。令和2年度には、胎生16.5日齢の脛骨にFGF2とメクロジンを添加した器官培養軟骨のRNA-seqを行った。FGF2を添加するとMAPKファミリーカスケードに属する遺伝子は有意に変動したが、メクロジンはこれを打ち消した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
令和2年度は、Achマウスにおいて最も有効だった２mg/kg/dayのメクロジンを7日齢のHypマウスに投与し、骨幹端部の骨梁および骨幹部の骨皮質の組織標本をVillanueva Goldner染色しosteoid volume/bone volume (OV/BV) を定量した。また、血清カルシウム、リン、FGF23を計測した。メクロジン2 mg/kg/dayをHypマウスに投与するとHypマウスで増加しているOV/BVは有意に減少した。また、Hypマウスの成長軟骨では肥大軟骨細胞層は肥厚しているがメクロジンの投与により肥大軟骨細胞層の厚みは有意に減少した。さらに、メクロジンはHypマウスの血清カルシウムおよびリン値を有意に上昇させたが、Hypマウスで上昇しているFGF23はさらに上昇した。一方、マイクロCTによる各種海綿骨や皮質骨のパラメータはメクロジン2 mg/kg/dayの投与により変化しなかった。
令和1年度に行なったcell freeキナーゼアッセイによりメクロジンはMAPK経路においてMAP3K3のリン酸化を抑制することが示唆された。メクロジンのMAPK経路抑制効果を検証するために、胎生16.5日の脛骨器官培養系を用いた。FGF2とメクロジンを投与して培養を行った後に軟骨よりRNAを抽出し、GSEA解析を行った。FGF2によりMAPKファミリーカスケードに属する遺伝子発現は変動し、メクロジンはこの変動を打ち消した。
令和2年度は、Achマウスにおいて有効性が認められた2 mg/kg/dayのメクロジンがHypマウスにおいても有効であることを示すことができた。また、脛骨器官培養軟骨においてメクロジンはMAPKファミリーカスケードに属する遺伝子を有意に変動させ、メクロジンがこれを抑制することを示した。以上により、本研究はおおむね順調に進んでいると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの研究よりメクロジンはMAPK経路においてMEK1/2のリン酸化を抑制することが予想されていた。しかし、令和1年度に施行したキナーゼアッセイでは、メクロジンはMEK1/2のリン酸化抑制効果は軽度だったのに対し、さらに上流のMAP3K3のリン酸化を抑制することが示唆された。令和2年度は、軟骨細胞においてFGFR3シグナルが亢進しMAPKファミリーカスケードに属する遺伝子の変動をメクロジンが抑制することを示した。令和3年度は、軟骨細胞における細胞内シグナルの検討を行うために、Rat chondrosarcoma（RCS）細胞にメクロジンを添加した後にFGF2を加えFGFR3シグナルが活性化した一定時間後にMAP3K3やMAP2K6のリン酸化抑制効果の評価に加え、ERK、p38、JNK経路における効果をウエスタンブロッティング法により評価する。
Achマウスで最も効果を発揮するメクロジン2 mg/kg/dayは、Hypマウスにおいても有効であることを令和2年度までに示すことができた。令和3年には、サンプルサイズを増やしメクロジン2 mg/kg/dayの有効性を検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
令和2年度は、胎児脛骨器官培養、RNA抽出、GSEA解析、マウスモデルへの投薬、組織学的検討を行ったが、解析したサンプル数は少なかった。令和3年度には、サンプル数を増やして組織学的検討を行う予定であり、各種染色を行うために使用額が生じる。また、細胞内シグナルの検討を行うため、細胞実験のための培養液、FGF2、薬剤、ウエスタンブロッティングを行うための消耗品等が必要である。
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