| 研究課題/領域番号 |
19K09697
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
柴田 泰宏 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 助教 (10534745)
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| 研究分担者 |
鵜川 眞也 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (20326135)
窪田 泰江 名古屋市立大学, 大学院看護学研究科, 教授 (00381830)
太田 裕也 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 臨床研究医 (20814255)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 過活動膀胱 / 酸感受性イオンチャネル / アシドーシス / 機械刺激受容体 / 膀胱 |
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| 研究実績の概要 |
過活動膀胱や神経因性膀胱における頻尿を抑制するための薬剤には抗コリン薬およびβ3受容体作動薬などが使用されている。しかし、いずれの薬剤も排尿筋上の受容体をターゲットとしており、膀胱の伸展刺激を受容して尿意の起点となるであろう膀胱の感覚神経をターゲットとした薬剤は未だに無い。これは尿意を受容する本態として想定されている機械刺激受容について不明な点が多いためである。これらを明らかにするため、私たちは線虫の機械刺激受容体の哺乳類ホモログであるASICファミリーに注目し、ASICファミリーのノックアウトマウスおよびノックインマウスを用いてその膀胱における分布と機能の詳細を検討することを計画した。私たちは、ASIC4が排尿機能に与える影響を観察するため、ASIC4ノックアウトマウスを用いたvoid spot assayによる排尿行動解析を行った。生理的条件下において、８週齢から１２週齢の野生型マウスおよびASIC4ノックアウトマウスの比較を行ったところ、ノックアウトマウスではプライマリースポット面積が小さくなる傾向があること、またスポット数が増大する傾向にあることから、野生型マウスと比較してASIC4ノックアウトマウスの最大膀胱容量は小さく、また頻尿を呈していることが示唆された。また、当研究室でまだ得られていないASIC2ノックインマウスおよびAISC2ノックアウトマウスをCRISPR/Cas9システムを用いて作出するための準備として、off-targetの少ないgRNAのベクターを設計するとともに、ノックインマウス作出のための遺伝子供与ベクターの設計を行った。相同アーム長は1kbp、ノックインに用いるTag配列はVSV-G配列を用いることとした。現在、本学の実験動物研究教育センターと協力し、次年度に繰り越した予算にて動物の作出を計画している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度において、我々はvoid spot assayを用いた野生型マウスとASIC4ノックアウトマウスを比較した排尿行動解析および当研究室でまだ得られていないASIC2ノックインマウスおよびAISC2ノックアウトマウスの作出の準備を行った。void spot assayについては一応の結論が得られたが、ASIC2遺伝子改変動物の作出については、CRISPR/Cas9システムを用いた遺伝子改変動物の作出についてはoff-targetの少ないgRNAのベクターの設計と、ノックインマウス作出のための遺伝子供与ベクターの設計を行ったところで年度末を迎えた。このため、実験計画および予算を次年度へ繰り越す事となった。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度に準備を行ったASIC2遺伝子ノックイン、ノックアウトマウス作出のためのCRISPR/Cas9 ベクターおよび遺伝子供与ベクターを用いて、実際の遺伝子改変動物の作出を行うことを次年度の第一の目標とする。このための予算は前記の通り繰り越しの申請をすでに行っている。また、動物の作出にあたり、本学の実験動物研究教育センターと緊密に連絡を取り、計画の実行について相談を行っている。
また、ASIC4についての電気生理学的解析の追加実験を行うため、パッチクランプ解析の準備としてASIC4-IRES2-Venusを組み込んだ発現ベクターを作製し、大量増幅とレジンカラムを用いた精製を既に行っている。これを用いて、培養細胞へのトランスフェクションを行い、各イオンの透過性など、これまでより更に詳細なASIC4のイオンチャネルとしての特性を明らかにすることを目標とする。。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
コロナ禍による実験計画の変更、その中でも動物飼育施設における動物飼育数制限が最も大きな要因となり、実験を繰り越す必要性が生じた。これに伴って実験計画が大きく遅れることとなった。現在、当研究室でまだ得られていないASIC2ノックインマウスおよびAISC2ノックアウトマウスをCRISPR/Cas9システムを用いて作出するための準備として、off-targetの少ないgRNAのベクターを設計、作製しており、次年度に繰り越した予算を用いて当大学実験動物研究教育センターと協力し遺伝子改変動物の作出を行う予定である。
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