| 研究課題/領域番号 |
19K09697
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
柴田 泰宏 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 助教 (10534745)
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| 研究分担者 |
鵜川 眞也 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (20326135)
窪田 泰江 名古屋市立大学, 大学院看護学研究科, 教授 (00381830)
太田 裕也 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 助教 (20814255)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 酸感受性イオンチャネル / 過活動膀胱 |
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| 研究実績の概要 |
過度の尿意や尿意切迫感といった排尿に関連する症状に悩む患者が多数存在する一方で、尿意を受容する機構についての全体像は解明されているとは言い難い状況にある。私たちはこれまでに機械刺激受容体候補遺伝子であるASIC（Acid Sensing Ion Channel：酸感受性イオンチャネル）ファミリーを中心に膀胱における尿意受容機構の解析を行ってきた。そのなかで、ASIC4遺伝子が膀胱平滑筋層に発現していること、および、アフリカツメガエル卵母細胞をもちいた発現系で機械刺激の一種である浸透圧変化によってASIC4を介した流入電流が増減することを見いだした。このことからASIC4が膀胱における機械刺激受容に何らかの役割を果たしていることが推察される。これらより、ASICファミリー、特にASIC4を主なターゲットとした膀胱の機械刺激受容機構、尿意発生機構の解明を目指すとともに、膀胱の感覚入力そのものを標的とした過活動膀胱治療に対する新規の治療戦略へとつなげることを目標として研究を計画した。
本年度においては、本人の新型コロナ感染症罹患と後遺症、ワクチン接種による熱発、同居家族の新型コロナウイルス感染による濃厚接触者認定数回などにより、当初の実験計画から計画変更の必要性が生じた。このため、行う研究を厳選し、主に遺伝子改変動物の作出に関する準備としてのコンストラクトの設計およびターゲティングベクター作製を中心とした。また、新型コロナウイルス感染症による特例処置を利用して予算の多くを次年度に繰り越すこととした。当該年度内に行った具体的な進捗状況については次項に記載する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
前項に記載したとおり、本年度の研究には計画変更の必要性が生じた。次年度に研究を加速させるため、本年度は新規遺伝子改変動物の作出の準備を中心に行った。ASICはファミリーを形成しておりASIC4の解析には他のファミリーについても留意して研究を行う必要がある。当教室ではこれまでにASIC1a, 1b, 3, 4のノックインマウスを作出している。今回、これらに加えてASIC2aおよびASIC2bノックインマウスを作出する事で、ASICファミリーの総合的、包括的な解析を行うための基盤が整うこととなる。ASIC2aにはPA tagおよびOLLAS tagを、ASIC2bには c-Myc tag およびtwin strep tagをそれぞれGSリンカーで繋いだものを用いることとした。本年度における具体的な進捗としては、野生型マウスからクローニングしたホモロジーアーム配列に上記タグアミノ酸配列をDNA配列に逆翻訳した配列を設計するとともに、これを組み込んだターゲティングベクターの作製と精製を行った。実際の遺伝子改変動物の作出とそれらを用いた研究の遂行は次年度に行う予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度に作製した前項ターゲティングベクターを用いて、まずASIC2aおよびASIC2bのタグノックインマウスを作出する。ES細胞を用いたコンベンショナルな方法を用いた場合、作出期間が長期となるため、CRISPR/Cas9システムを用いた遺伝子改変マウス作出の実績がある筑波大学へ委託する予定である。当教室では現在までにASIC１、ASIC3およびASIC4ノックインマウスが利用可能である。これらを用いて膀胱組織内のASICの局在を検討する。蛍光顕微鏡で直接ノックインタンパクの蛍光を観察するが、発現量が少なく、蛍光が得られない場合は抗タグ抗体を利用し、必要であれば増感法を用いるなどして局在を検討する。複数のASICが同一細胞に検出された場合、これらが機能的にヘテロマーを形成している可能性を検討するため、融合させたタグタンパクに対する抗体を利用し、免疫沈降法による生化学的解析を行う。いずれも対照群としてTag-negativeである野生型マウスを使用できるため通常と比較して高い特異度が保証される。
これに加え、我々はこれまでにASIC1、ASIC3、ASIC4それぞれのノックアウトマウスを作出し、さらにASIC1/3/4トリプルノックアウトマウスを交配によって得ている。これに加えて昨年度ASIC2ノックアウトマウスを入手した。本年度はこれらの交配を進め、ASIC null マウスを得るとともに、これらを用いて膀胱内圧測定、Frequencey-Voiding chart解析、void spot assayなどを行う。膀胱内圧測定は、ラットで行う場合と比較してマウスではそのサイズから技術的な困難を伴うが、これについては研究分担者の所属する名古屋市立大学腎・泌尿器科学分野の協力の下に行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は、本人の新型コロナ感染症罹患と後遺症、ワクチン接種による熱発、同居家族の新型コロナウイルス感染による濃厚接触者認定数回などによる遅延から、当初の実験計画から計画変更の必要性が生じた。このため、新型コロナウイルス感染症による特例処置を利用し、予算の多くを次年度に繰り越すこととした。次年度に研究を加速させるため、本年度は新規遺伝子改変動物の作出の準備を中心に行った。具体的には、ASIC2aおよびASIC2bノックインマウスを作出する事で、ASICファミリーの総合的、包括的な解析を行うための基盤を整える。ASIC2aにはPA tagおよびOLLAS tagを、ASIC2bには c-Myc tag およびtwin strep tagをそれぞれGSリンカーで繋いだものを用いる。本年度における具体的な進捗としては、野生型マウスからクローニングしたホモロジーアーム配列に上記タグアミノ酸配列をDNA配列に逆翻訳した配列を設計するとともに、これを組み込んだターゲティングベクターの作製と精製を行った。実際の遺伝子改変動物の作出とそれらを用いた研究の遂行は次年度に行う予定である。
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