| 研究課題/領域番号 |
19K09769
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
井平 圭 北海道大学, 医学研究院, 特任助教 (50813820)
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| 研究分担者 |
董 培新 北海道大学, 医学研究院, 助教 (50602504)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | B7H3 / Endometrial cancer |
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| 研究実績の概要 |
研究計画に基づき、B7H3遺伝子の機能解析とその機構の解析を行った。具体的には、子宮体癌細胞におけるB7H3の機能を解明するため、B7H3遺伝子過剰発現ベクターを構築し、またB7H3遺伝子を特異的にノックダウンするsiRNAを設計した。更に、最先端のゲノム編集技術CRISPR/Cas9法を用い、B7H3遺伝子をノックアウトするためのベクターを構築し、それぞれ子宮体癌細胞株に導入した。B7H3発現の増加或は低下をWestern blot法により確認した。B7H3の過剰変動による子宮体癌の浸潤能、増殖能、薬剤耐性、癌幹細胞性形質の亢進は細胞アッセイで明らかになった。癌転移関連遺伝子及び癌幹細胞関連遺伝子発現の変化をWestern blot法で検討した結果、B7H3は子宮体癌細胞のEMT形質を増強して、子宮体癌の進展と抗癌剤耐性の獲得を促進することを発見した。B7H3の下流シグナル伝達経路の全体像を解明するためには、B7H3の過剰発現とノックアウトによる遺伝子発現量の変化をAgilent microarrayにより網羅的に解析し、発現量が有意に変動する遺伝子群を抽出した。更にGene Ontology、Gene Set Enrichment Analysis、生物学的KEGG経路の解析を行い、潜在的下流シグナルを解明した。B7H3の発現変動に伴うPI3K/AKTまたSTAT3経路分子の発現変化をWestern blot法により検討することで、B7H3の高発現によって、PI3K/AKTまたSTAT3経路が活性して、EMTが誘導され、子宮体癌の進展と抗癌剤耐性が促進される分子機序が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究計画に基づき、体癌細胞におけるB7H3遺伝子の機能解明とB7H3の下流シグナル伝達経路の同定を行うことで、B7H3はその下流にあるPI3K/AKTまたSTAT3経路を活性化することにより、EMTの誘導また体癌の進展と抗癌剤耐性を促進できる可能性を明らかにした。これは研究計画通りの成果であり、順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
B7H3を制御する分子機構（特に非翻訳RNA）の同定を行う。体癌患者の手術組織切片から、Laser Microdissection法により癌と周辺正常組織を選択的に採取し、total RNAを抽出する。Agilent miRNA microarrayと次世代シーケンス解析を用い、網羅的な発現解析により、体癌進展に関与するmiRNA、長鎖非翻訳RNAと遺伝子を同定し、定量PCRでその発現を確認する。我々の研究室で樹立された体癌細胞株を活用し、またin silico解析でB7H3を制御する非翻訳RNAの同定を行う。更に各非翻訳RNAの機能を細胞アッセイの方法で解析する。体癌細胞株を使い、B7H3発現に対するmiR-26a/EZH2またmiR-26a/TGF-beta経路の調節作用の有無を多角的に検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究は計画通り進展しており、B7H3の発現制御に関わる分子シグナル伝達経路の解明に必要な試薬及び少数精鋭を購入する必要があったため。研究成果を報告するための学会参加を予定している。論文掲載料に充てる予定もある。
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