| 研究課題/領域番号 |
19K09795
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| 研究機関 | 秋田大学 |
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研究代表者 |
佐藤 敏治 秋田大学, 医学部附属病院, 講師 (70636183)
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| 研究分担者 |
佐藤 直樹 秋田大学, 医学系研究科, 准教授 (40447199) [辞退]
清水 大 秋田大学, 医学部附属病院, 講師 (60400503)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 漿液性癌 / 細胞診液状検体 / TP53変異 / 次世代シーケンサー |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、①TP53の遺伝子変異検出の単独で漿液性腺癌を診断することでコストを低減②子宮内膜細胞診液状検体を使用することで、漿液性腺癌診断の感度・特異度を改善③マイクロRNA検査で遊離DNA検出不能検体や前癌病変を予測できるかを明らかにすることである。癌だけでなく前癌病変をも診断し、単一の遺伝子検査(TP53変異)のみで診断でき、検査のための新たな装置や侵襲を必要としないことが本研究の独自性である。
本年度は、①細胞診用液状検体の採取・保存の追加と②細胞診用液状検体からの遊離DNAの抽出・PCRによる増幅・サンガーシーケンスによるTP53遺伝子変異の検出のパイロットスタディを行った。
①本年度は漿液性癌症例が2例と少なく、キットの検体数に満たないため凍結保存とし次年度での検査予定とした。②本年度の1例は子宮体癌・卵巣癌の重複癌であり、TP53変異のポジティブコントロールとして使用できるか検討してみた。摘出した子宮から速やかに内膜細胞診を施行し、採取した液状細胞診検体からのDNA抽出を行った。QIAamp DNA Micro Kitにて300ng/μlのDNA収量を得た。TP53遺伝子変異のターゲットシーケンス用の16か所のプライマー（Forshewら. Sci Transl Med. 2012）を行い通常のPCRを施行した。25 cycleにて１か所のプライマーを除き、PCR産物が確認され、サンガーシーケンスを行った。結果、１か所の病的バリアント（rs483352695）、１か所の良性欠失（rs587782769）、２か所のイントロンバリアント（rs1642785, rs59758982）をみとめた。
細胞診液状検体の溶媒であるTACAS GYN Vialに融解したDNAが、本実験系で抽出・PCR可能であることがわかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年は、漿液性腺癌の手術検体の採取を行ったが、2例しか集まらなかった。1例は子宮体癌・卵巣癌の重複癌であり、TP53変異のポジティブコントロールとして使用できるか、検討してみた。
摘出した子宮から速やかに内膜細胞診を施行し、採取した液状細胞診検体からのDNA抽出を行った。-80℃に凍結していた液状細胞診検体を融解し、15,000rpmで5分間遠心して上清を分注。沈殿物をlysis bufferにて溶解しQIAamp DNA Micro KitのDNAカラムに吸着。その後、分注していた上清もカラムに吸着させ100μlでDNAを抽出。Nano DropにてDNA濃度測定し、300ng/μlの収量を得た。TP53遺伝子変異のターゲットシーケンス用の16か所のプライマー（Forshewら. Sci Transl Med. 2012）を行い通常のPCRを施行した。25 cycleにて１か所を除き、PCRプロダクトを泳動にて確認し、ゲル切り出し抽出しサンガーシーケンスを行った。結果、１か所の病的バリアント（rs483352695）、１か所の良性欠失（rs587782769）、２か所のイントロンバリアント（rs1642785, rs59758982）をみとめた。
細胞診液状検体の溶媒であるTACAS GYN Vialに融解したDNAが、本実験系で抽出・PCR可能であることがわかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
8例程度でパイロットスタディを行い、検体採取時期・採取法・シーケンスの冗長度の最適化をする。検出可能と判断された場合、分子バーコードとsingle primer extensionを組み合わせたカスタムパネルを用いたNGS変異解析（QIAseq Targeted Panels）を行う。これにより、パイロットスタディのプライマーで検出できない200bp以下のDNA断片も検出が理論的に可能となる。より検出感度と正確性の向上させたデータを基に、漿液性腺癌のcf-DNAのTP53変異検出による漿液性腺癌の感度・特異度を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナ流行のため、学会出張がなかったこと、予定検体が集まっていないため次世代シーケンサーをまだ施行していないため予算を次年度に繰り越した。
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