| 研究課題/領域番号 |
19K09801
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
千草 義継 京都大学, 医学研究科, 助教 (80779158)
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| 研究分担者 |
近藤 英治 京都大学, 医学研究科, 准教授 (10544950)
最上 晴太 京都大学, 医学研究科, 助教 (40378766)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 早産 / 羊膜 / TLR4 |
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| 研究実績の概要 |
早産は新生児死亡、後遺症の重要な原因であり、早産の予防・治療は周産期医学領域における喫緊の課題である。腟分泌物中のfetal fibronectin(fFN)は早産マーカーであるが、fFN中に含まれるExtra domain A (EDA)が、ヒト羊膜間葉細胞に存在するToll-like receptor 4(TLR4)-MD2と相互作用し、COX-2、サイトカイン、MMPの産生を促進することで早産が惹起される。そこで、本研究ではEDA-TLR4-MD2相互作用に必須の結合部位（アミノ酸残基）を特定し、その部位を改変した変異EDAを作成する。さらにその変異EDAが、ヒト羊膜間葉細胞において、TLR4-MD2の活性化を阻害することで、炎症（子宮頸管熟化・子宮収縮）およびコラーゲン分解（羊膜破綻）を抑制し、早産治療に資するか否かの効果判定を行うことを目的として開始した。
まず、大腸菌によるリコンビナントEDAを作成した。このwild type EDAを構成する90のアミノ酸配列を4分割し、それぞれのアミノ酸を欠失した欠失EDAを作成し、それぞれのEDAがTLR4-MD2との相互作用を持つかどうかを、HEK-blue-hTLR4 cellsを用いて検討した。その結果1つの欠失EDAはTLR4-MD2と相互作用しないことが判明した。この欠失EDAは羊膜間葉細胞に添加しても、COX2やIL8などのTLR4下流遺伝子の発現を増強させなかった。したがってこの欠失部位にEDAとTLR4-MD2とが結合するアミノ酸残基があることが明らかとなった。
さらにわれわれはコンピューター上におけるタンパク質立体構造・相互作用シミュレーションによって、EDAがTLR4およびMD2と結合すると予想されるアミノ酸残基を、6か所抽出し、これらのアミノ酸をそれぞれ変異させたEDAを作成した。これらの変異EDAが羊膜間葉細胞においてTLR4下流遺伝子を増強させるか否かについても検討中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
90アミノ酸からなるEDAのうち、TLR4-MD2との相互作用に必須の部位は、系統的な欠失EDAの作成により、20個のアミノ酸残基がこれに必須であることが判明した。さらにわれわれはコンピューター上におけるタンパク質立体構造・相互作用シミュレーションによって、EDAがTLR4およびMD2と結合すると予想されるアミノ酸残基を、6か所抽出し、これらのアミノ酸をそれぞれ変異させたEDAを作成して実験を遂行中であり、進展は順調である。
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| 今後の研究の推進方策 |
2019年度で作成した欠失EDA（アミノ酸20個を欠失）がTLR4-MD2と結合しなかったことから、この20個のアミノ酸のなかにEDA-TLR4-MD2相互作用に必須の部位があるため、さらにこの20個のアミノ酸を細分化して欠失させたEDAを作成し、EDA-TLR4-MD2相互作用に必須のアミノ酸を特定させる。またその欠失EDAが羊膜間葉細胞においてTLR4下流遺伝子の発現を抑制することを確認する。つづいて、EDA-TRL4-MD2相互作用に必須のアミノ酸部位を変異させた変異EDAを作成し、変異EDAをpretreatした間葉細胞にwild type EDAを添加培養し、COX-2, IL-8, MMP1, MMP9のmRNA発現が抑制されるか否かをqPCRで検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
該当金額では必要試薬の購入が難しく、次年度予算と併せて必要試薬購入予定として繰越した。
次年度予算と併せて試薬代に充当する。
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