| 研究課題/領域番号 |
19K09850
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| 研究機関 | 鹿児島大学 |
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研究代表者 |
黒野 祐一 鹿児島大学, 医歯学総合研究科, 客員研究員 (80153427)
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| 研究分担者 |
宮下 圭一 鹿児島大学, 医歯学域鹿児島大学病院, 助教 (30585063)
川畠 雅樹 鹿児島大学, 医歯学域鹿児島大学病院, 助教 (30585112)
永野 広海 鹿児島大学, 医歯学域鹿児島大学病院, 講師 (60613148)
大堀 純一郎 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 准教授 (90507162)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ホスホリルコリン重合体 / 経鼻免疫 / アジュバント作用 / ハプテン作用 / IgE |
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| 研究実績の概要 |
結合型ホスホリルコリン（PC）重合体（Reactive MPC：R-MPC）のアジュバント効果を確認するため、昨年度に引き続き卵白アルブミン（OVA）を抗原として、R-MPC+OVA群（A群）、R-MPC+グリシン+OVA群（B群）そしてR-MPCのアジュバント作用を比較するためコレラトキシン（CT）＋OVA群（C群）、OVA単独群（D群）、R-MPC単独群（E群）の5群にマウスを分類し、それぞれの薬剤を3回経鼻投与した。
その結果、OVA特異的免疫応答はC群が最も高く、B群、A群と続き、D群とE群ではOVA特異的免疫応答は認められなかった。一方、PC特異的免疫応答はA群が最も高く、B群、E群と続き、C群とD群ではPC特異的抗体価の上昇はみられなかった。したがって、R-MPCはアジュバント作用を有するが、そのOVA特異的免疫応答におけるアジュバント作用はOVAと結合せずとも得られ、むしろ結合することでアジュバント作用が低下することから、R-MPCが独自に樹状細胞等の根源提示細胞を活性化することで得られると推測される。それに対してPCに対する免疫応答は、R-MPCとOVAが結合することで、R-MPCがハプテン、OVAがキャリアタンパクとして働いて増強されると考えられる。
また、それぞれの群における血清IgE抗体量をELISAで定量したところ、C群ではA群、B群と比較して総IgEおよびOVA特異的IgE抗体がともに有意に増加した。したがって、R-MPCはTh2型よりTh1型の免疫応答を誘導すると思われる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
グリシンでの処理によってR-MPCの結合性が消失することが判明したことから、R-MPCを結合させたOVAとグリシン処理した非結合型R-MPCと混合したOVAとで免疫応答を比較した。その結果は当初の予想と異なり、OVA特異的免疫応答は非結合型R-MPCのほうがR-MPCよりも高く、R-MPCのアジュバント作用の活性化にタンパク抗原との結合は必須でないことが示された。しかし、PC特異的免疫応答は結合型R-MPCのほうが高かった。さらにこれらのPC製剤のアジュバント作用をCTと比較したところ、CTよりその作用は弱いものの、結合型および非結合型R-MPCはともに優れたアジュバント作用を有することが示された。これらの成績から、タンパク抗原特異的免疫応答の誘導には非結合型R-MPCのほうが優れるが、広域スペクトラムを有するワクチンの開発には結合型MPCをアジュバントとして用いるほうが有効なことが確認された。
また、IgGサブクラス抗体価を測定したところ、R-MPCをアジュバントとして用いるとIgG1抗体価のほうがIgG2a抗体価よりも高値であり、Th2型の免疫応答が有意であり、IgE産生による副反応の誘発が懸念された。そこで今回、総IgEおよびOVA特異的IgEを測定したところ、R-MPCはCTと異なりIgEの産生が極めて低く、安全性も問題ないことが示唆された。
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| 今後の研究の推進方策 |
R-MPCのアジュバント作用が確認され、R-MPCがハプテンとして働くことが推測されたが、その機序は不明である。そこで、マウス脾細胞から抗原提示細胞を分離し、これにR-MPCを加えそのサイトカイン産生を観察し、その機序を明らかにする予定である。すでにPCがリポ多糖体（LPS）と同じくTLR-4のリガンドとなることが報告されており、低分子量のPC重合体であるR-MPCもTLR-4を介して、IL-12p40およびTNF-α、IL-４、IFN-γ等のサイトカイン産生を誘導すると推測される。これにより、R-MPCのアジュバント作用ならびにIgE産生を抑制する機序が明らかになると思われる。
また、粘膜接着性が高いPC重合体製剤に関しては、in vitroで細菌付着抑制作用が証明されたことから、これを含嗽薬としてヒトに投与し、頬粘膜上皮細胞への細菌付着抑制作用を確認する。また、この製剤が粘膜面を覆い保護することから、気炎物質による炎症の惹起を阻止できる可能性があり、ヒト培養上皮細胞でTLR2およびTLR3を発現することが知られているDetroit cellをそれぞれのリガンドであるPam3CSK4、 Poly(I:C)で刺激してIL-8の産生を観察し、その抗炎症作用を検討する。さらにPC重合体には保湿作用があり、口腔粘膜の乾燥抑止作用についても検討する。そして、これらの研究成果をもとに上気道感染の治療および予防に有効な新たな薬剤の開発を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
R-MPCのアジュバント作用をさらに詳細に検討するためには、マウスを用いた追加実験が必要である。しかし、本年度から当大学の動物実験施設の工事が実施され、一時期動物実験が行えず、現在も飼育できるマウスの数が制限されている。そのため、本年度に予定していた実験を次年度に行うこととし、動物ならびに抗体価等を測定するための試薬などの購入費を次年度に使用することとした。また、現在使用しているR-PMCおよび粘膜接着性が高いPC重合体製剤は日油（株）から3年前に供与してもらったもので、予備実験でその活性が低下していることが明らかになった。そのため、日油（株）に新しい製剤の供与を依頼したが、その製造が本年度の実験に間に合わず、こうしたことが研究の遂行および研究費の使用を次年度に繰り越す要因となった。
しかし、未だ制約はあるものの動物実験が可能となり、新しいPC製剤も入手できたので、研究を引き続き実施できる状況が整っている。そこで、経鼻免疫そして脾細胞を採取するためのマウス、ヒト培養上皮細胞、TLRのリガンドであるPam3CSK4、 Poly(I:C)、各種サイトカインの測定キット等]に繰り越された予算を使用し実験を遂行する予定である。
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